本文主要从以下几部分展开： 第一部分CNTF目的基因的获取和构建、扩增、纯化Ad-CNTF-IRES-GFP 目的： 本课题欲获取CNTF目的基因和构建、扩增、纯化Ad—CNTF—IRES—GFP。 材料和方法： 先从pMEG—CNTF质粒中PCR法扩增CNTF目的基因，并送测序证实扩增的CNTF基因与Genebank相符；再用限制性内切酶SalⅠ和BglⅡ酶切下pMEG—CNTF质粒中的CNTF目的基因，插入Psp—IRES—GFP质粒中，构建Psp—CNTF—IRES—GFP质粒；再用限制性内切酶切下Psp—CNTF—IRES—GFP质粒中的CNTF—IRES—GFP，插入PDC316质粒中，构建PDC316-CNTF—IRES—GFP质粒。连接CNTF—IRES—GFP和PDC316，转化感受态大肠杆菌，挑选单克隆菌落，大量扩增单克隆菌落，SDS裂解法制备PDC316-CNTF—IRES—GFP质粒，纯化质粒。 最后，再用PDC316-CNTF—IRES—GFP质粒和骨架质粒PBHG在脂质体的作用下构建Ad—CNTF—IRES—GFP腺病毒，并在293-LP细胞扩增、纯化，并鉴定。 结果： 成功构建Ad—CNTF—IRES—GFP腺病毒载体，测得Ad—CNTF—IRES—GFP腺病毒的pfu为2.3×1011。 结论： 成功构建Ad—CNTF—IRES—GFP腺病毒载体，为CNTF的基因治疗提供手段。 第二部分重组腺病毒载体Ad-CNTF-IRES-GFP对MSC表达CNTF的影响 目的： 本课题欲观察重组腺病毒载体Ad—CNTF—IRES—GFP对MSC表达CNTF的影响。 材料和方法： 先体外培养MSCS细胞，用流氏细胞仪测定MHC1，CD13，CD44和MHC2，CD45，CD34，鉴定MSCS细胞。并分三组，用流氏细胞仪测定Ad—GFP病毒转染后的MSCS和Ad—CNTF—IRES—GFP转染后的MSCS表达的MHC1，CD13，CD44和MHC2，CD45，CD34情况，鉴定MSCS细胞的活性有无改变；再观察Ad—GFP转染的MSCS和Ad—CNTF—IRES—GFP转染的MSCS的荧光情况，并计算转染率，用CNTF的ELISA试剂盒测定三组上清液中CNTF的浓度，观察三组CNTF分泌情况。结果采用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析。用单因素方差分析p<0.05差异有显著性。 结果： 1.MSCS表达MHC1，CD13，CD44不表达MHC2，CD45，CD34。Ad—GFP转染后的MSCS和Ad—CNTF—IRES—GFP转染后的MSCS表达MHC1，CD13，CD44不表达MHC2，CD45，CD34，证实MSCS的活性没有改变。 2.DIL染色的MSCS在倒置荧光显微镜发出强的红色荧光，发光率在99％左右。Ad—GFP转染的MSCS因GFP发出强的绿色荧光。Ad—CNTF—IRES—GFP转染的MSCS因GFP在CNTF后面，发出较Ad—GFP稍弱的绿色荧光。两者的转染率在90％左右。 3.ELISA试剂盒的测定结果显示，MSC—Ad—CNTF—IRES—GFP分泌的CNTF较MSC、或MSC—Ad—GFP增高20倍。MSC和MSC—Ad—GFP均分泌低浓度的CNTF。 结论： Ad—GFP转染后的MSCS和Ad—CNTF—IRES—GFP转染后的MSCS活性没有改变。Ad—CNTF—IRES—GFP病毒感染MSC后可表达显著升高的CNTF。 第三部分重组腺病毒转导的MSC导向的CNTF基因靶向性治疗C57小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的体内试验 目的： 本课题欲探讨重组腺病毒转导的MSC导向的CNTF基因靶向性治疗C57小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的疗效及机制，为MS临床治疗提供实验依据。 材料和方法： 先用MOG35-55建立C57BL/6小鼠的EAE模型，将重组Ad-CNTF-IRES-GFP转染的MSC移植治疗EAE小鼠，与MSC单独治疗组、rAd-GFP转染的MSC治疗组和PBS对照组进行比较，观察其病情评分；动态观察血和CNS的免疫学指标变化以及免疫器官脾脏和CNS的MSC-Ad-CNTF-IRES-GFP数量；病理观察CNS炎症细胞浸润、髓鞘和轴突的损伤情况；电镜观察髓鞘和轴突以及少突胶质细胞的损伤情况；免疫荧光、免疫组化观察CNS凋亡蛋白Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2表达以及CD3细胞、炎性细胞因子TNF-α，IFN-γ表达情况；Western-blot和双色免疫荧光、免疫组化观察神经生长因子CNTF和BDNF表达，免疫荧光、免疫组化观察少突胶质细胞前体细胞数量。所有的数据用平均数±SD表示。采用SPSS13.0统计分析软件进行分析。结果用单因素方差分析，p<0.05差异有显著性。 结论： 1.成功建立C57BL/6小鼠的EAE模型。 2.本文证实MSC细胞移植治疗的C57BL/6小鼠的EAE临床病情减轻；外周血的免疫学指标向抗炎症反应方向发展；CNS病变部位的炎症细胞浸润减轻，CD3细胞减少，TNF—alpha减少；少突胶质细胞前体细胞数量增多；髓鞘变性、轴突变性，少突胶质细胞损伤减轻；分泌神经生长因子CNTF和BDNF增多，抗凋亡蛋白BCL—2表达增多，凋亡蛋白Caspase—3表达减少。 3.本文发现MSC—Ad—GFP病毒转染的MSC细胞移植治疗的C57BL/6小鼠EAE EAE临床病情减轻；外周血的免疫学指标向抗炎症反应方向发展；CNS炎症细胞浸润减轻，CD3细胞减少，TNF—alpha减少；少突胶质细胞前体细胞数量增多；髓鞘变性、轴突变性，少突胶质细胞损伤减轻；分泌神经生长因子CNTF和BDNF增多，抗凋亡蛋白BCL—2表达增多，凋亡蛋白Caspase—3表达减少。 4.本文发现Ad—CNTF—IRES—GFP病毒转染的MSC细胞移植治疗的C57BL/6小鼠EAE比单独给MSC细胞移植治疗的EAE和Ad—GFP病毒转染的MSC细胞移植治疗的EAE更有效。 5.本文首次发现CNTF可以明显趋化MSC—Ad—CNTF—IRES—GFP去脾脏和脊髓定居。 6.本文阐明了重组Ad—CNTF—IRES—GFP病毒转染的MSC细胞移植治疗的C57BL/6小鼠EAE的机制是减低外周血TNF—alpha，水平和外周血IFN—gama水平，MSC可以去脾脏调节免疫功能，更重要的发现是CNTF可以趋化MSC—Ad—CNTF—IRES—GFP去脾脏和脊髓定居，可明显降低病变部位的炎症细胞包括CD3细胞数量和炎性细胞因子TNF—α，可明显升高病变部位的CNTF和BDNF水平的表达和NG2细胞在病变部位的数量，明显减轻病变部位的髓鞘和轴突变性，和少突胶质细胞损伤，促进EAE小鼠脊髓病变部位抗凋亡蛋白BCL—2表达和减少促凋亡蛋白Caspase—3的表达，为Ad—CNTF—IRES—GFP转染的MSC移植治疗MS提供了理论依据。