目的研究重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者与正常人调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)数量及功能的差异;探索并建立体外细胞培养体系,验证Treg细胞对其他免疫细胞数量与功能的影响,阐明在SAA发病过程中Treg细胞所扮演的角色,并为开发新的治疗方法提供理论依据。方法研究对象为天津医科大学总医院自2014年1月至2016年1月收治的SAA初治患者、治疗后恢复期(包括完全缓解与部分缓解)患者及正常对照者。第一部分采用流式细胞术检测SAA初治患者、SAA恢复期患者和正常对照者外周血CD4~+CD25~+CD127dim Treg细胞数量及功能分子T淋巴细胞毒性相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4)、穿孔素(Perforin)、CD39、CD73、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR)、T细胞活化衔接因子(linker for activation of T cells,LAT)的表达情况,并与临床造血与免疫指标作相关性分析。第二部分免疫磁珠分选SAA患者和正常对照CD4~+CD25~+CD127dim Treg细胞及CD4~+CD25-效应T细胞(effective T cells,Teff),应用CD3/CD28单抗包被的磁珠加上高浓度IL-2刺激,体外培养Tregs,分组比较细胞增殖情况,ELISA检测培养基上清IL-10水平。将SAA患者/正常对照的Treg/Teff细胞混合交叉培养,CCK-8检测Teff细胞增殖,ELISA检测培养基上清IFN-γ水平。第三部分免疫磁珠分选SAA患者和正常对照Treg细胞,实时荧光定量PCR检测CTLA-4 mRNA的表达情况;体外诱导SAA患者骨髓单个核细胞成为树突状细胞(DC),将其分别与SAA患者、正常对照者的Treg细胞共培养,流式细胞术分析DC表面CD80、CD86的表达。第四部分采用流式细胞术检测SAA患者和正常对照Treg细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)蛋白的表达,免疫磁珠分选Treg细胞,实时荧光定量PCR检测TRAIL mRNA的表达。结果第一部分初治组Tregs/CD4~+T百分比为(2.94±0.65)%,较恢复组(4.07±1.17)%和正常对照组(4.98±1.38)%显著降低(P<0.01);初治组Treg绝对细胞数量与恢复组、正常对照组相比也显著下降(P<0.01),完全缓解组与部分缓解组也有显著差异(P<0.01)。初治组Treg细胞CTLA-4的表达率为(9.11±5.57)%,显著低于正常对照组(15.00±8.30)%(P<0.05);与Tregs百分比相乘后,初治组(0.26±0.16)%和恢复组(0.34±0.19)%较正常对照组(0.64±0.34)%下降更为显著(P<0.01)。初治组Tregs穿孔素的表达率为(3.80±2.54)%,略高于正常对照组(1.88±1.55)%和恢复组(2.78±2.52)%;与Tregs/CD4~+T%相乘后,初治组(0.10±0.06)%不再高于对照组(0.09±0.09)%。而Tregs CD39、CD73和GITR的表达率在三组之间均无明显差异;但与Tregs/CD4~+T%相乘后,初治组均低于正常对照组。初治组、恢复组和正常对照组Tregs LAT表达率分别为(3.80±4.35)%,(2.77±3.41)%和(1.48±1.20)%;与Tregs百分比相乘后变为(0.11±0.11)%、(0.10±0.10)%和(0.09±0.09)%。SAA患者Tregs/CD4~+T%与中性粒细胞绝对值(r=0.533;P=0.000),血红蛋白(r=0.337;P=0.024),血小板计数(r=0.355;P=0.017),及网织红细胞百分比(r=0.393;P=0.008)均呈正相关。第二部分分选后的Treg和Teff细胞的纯度均在90%以上。体外培养8天后,Treg细胞数量可扩增约10倍,且纯度仍保持在约60%。细胞生长曲线显示初治患者Tregs甚至比恢复组和正常对照的增殖能力更强。初治组、恢复组和正常对照组外周血/骨髓的Treg细胞增殖倍数分别为(17.54±10.34)/(9.21±8.54),(8.05±5.67)/(11.29±18.28)和(6.14±8.80)/(3.71±2.84)。初治组、恢复组和正常对照组Treg细胞培养基上清液中IL-10的浓度分别为(27.82±35.92)pg/ml,(44.98±64.30)pg/ml和(50.94±65.91)pg/ml。交叉培养后,Teff细胞的增殖率在(正常对照Teff∶正常对照Treg),(正常对照Teff∶SAA Treg),(SAA Teff∶正常对照Treg)和(SAA Teff∶SAA Treg)分别为(1.89±0.49),(1.86±0.61),(1.94±0.64),(1.90±0.64),无统计学差异。四组的培养上清中IFN-γ浓度按以上顺序依次为(25.87±24.07)pg/ml,(21.89±18.65)pg/ml,(15.63±9.35)pg/ml,和(10.16±5.52)pg/ml,(正常对照Teff∶正常对照Treg)组显著高于(SAA Teff∶SAA Treg)组(P<0.05)。第三部分初治组、恢复组和对照组Treg细胞内CTLA-4 mRNA水平(2-ΔΔCt)分别为(1.32±1.05)、(1.00±1.46)和(1.73±1.42),其中恢复组显著低于对照组(P<0.05),初治组稍高于恢复组、低于对照组(P=0.48),趋势与CTLA-4蛋白表达水平相一致。流式检测SAA m DC单独培养后CD80、CD86的表达率为20.43%、47.80%,SAA m DC∶SAA Treg共培养后CD80、CD86的表达率为18.33%、43.93%,SAA m DC∶正常对照Treg共培养后CD80、CD86的表达率为19.59%、45.98%。第四部分流式检测初治组Treg细胞TRAIL的表达率为(23.83±12.19)%,有略高于恢复组(19.71±10.09)%和正常对照组(20.09±9.57)%的趋势(P>0.05),后两者之间没有差异。PCR检测Treg细胞内TRAIL mRNA水平,初治组、恢复组和对照组2-△△Ct分别为(44.07±81.56)、(108.51±253.19)和(15.50±36.23),趋势与蛋白水平相一致。结论1、SAA患者CD4~+CD25~+CD127dim Treg细胞数量显著减少,无论是相对数量还是绝对数量,且与各项临床病情指标呈显著正相关,经过强化免疫抑制治疗(IST)可得到明显改善。2、SAA患者Treg细胞CTLA-4的表达显著减少,表明CTLA-4可能是SAA患者Treg异常的主要因素;穿孔素表达较高可能是一种代偿,但由于Treg整体细胞数量不足,代偿也不足。而CD39、CD73和GITR所介导的抑制机制、单个Treg细胞的存活能力、及LAT在Treg中所发挥的活化和信号转导功能可能并未受损。3、SAA患者体内的Treg细胞可被成功分离纯化,且应用CD3/CD28单抗的磁珠加高浓度IL-2可在体外成功扩增Treg细胞;SAA患者的Treg甚至具有比正常对照更强的增殖能力;扩增后的Treg可有效抑制Teff增殖及IFN-γ的分泌。4、Treg细胞表达的CTLA-4在体外对DC细胞CD80、CD86的表达有一定的下调作用,但还需进一步验证。5、SAA发病机制中,Treg细胞TRAIL介导的凋亡机制并不存在明显缺陷。