研究背景创面愈合是一个连续性的生物学过程,受多种因素的调控,按照时间先后顺序,可分为止血期、炎症期、增殖期及重塑期。这四个时期相互重叠、互相影响,其中任何阶段发生异常,都可能导致创面迁延不愈,甚至形成慢性难愈性创面。尽管近些年大量的医用生物材料被研发以用于创面治疗,但它们大多局限于单一功能,难以从多个时期多个方面促进创面愈合,缺乏综合性治疗策略。在众多的创面治疗方法中,负压创面治疗技术（negative pressure wound therapy,NPWT）因在引流创面渗液、减轻创面炎症反应、促进肉芽组织增生和诱导创面血管生成等方面作用显著,现已成为临床上治疗慢性难愈性创面最有效的技术之一。它的作用原理是以泡沫敷料填充创面,再覆盖生物半透膜封闭创面,通过导管将负压吸引装置和泡沫敷料相连接,然后再对创面施加一定的负压,以实现对创面渗液的持续吸引作用。NPWT虽然能为创面提供良好的愈合环境,但仍具有一定局限性。因为当创面愈合进入增殖期后,需要足够的表皮细胞从创缘向创面中心定向迁移以覆盖创面,完成再上皮化。而创面再上皮化过程包括表皮细胞迁移、增殖和分化,尤其是表皮细胞的迁移过程,是再上皮化过程的限速步骤和关键环节,该功能受损将阻碍再上皮化进程,导致创面愈合延迟,甚至不愈合,发展成慢性难愈性创面。但NPWT虽然能通过促进肉芽增殖来为表皮细胞迁移提供良好的创基条件,但不能直接促进表皮细胞定向迁移。随着对创面愈合过程及慢性难愈性创面的深入研究,发现创缘电场（electric fields,EFs）是引导表皮细胞定向迁移的最主要的生物学信号。创面一旦形成,损伤部位电势消失,立即产生创缘为正极,创面中心为负极的内源性创缘EFs,其强度约为42～200 mV/mm,由创缘向创面中心逐渐降低。在慢性难愈性创面中,创面内源性EFs发生异常或趋于衰竭是导致创面愈合困难的重要原因之一。体外创面模型中,给予角质细胞一定强度范围内的直流EFs后,可诱导表皮细胞向负极定向迁移,迁移方面朝向创面中心,当逆转电场方向后细胞的迁移方向也随之发生逆转,远离创面中心;且表皮细胞迁移的速度会随着电场强度的增加而加快。以上研究表明,创缘内源性EFs对引导表皮细胞定向迁移发挥着至关重要的作用。因此,若通过外源性EFs模拟或加强创缘内源性EFs,增加创面电信号来引导表皮细胞向创面中心定向迁移,则有望促进创面再上皮化进程。但关于创缘电场对表皮细胞迁移作用的研究多局限于体外细胞实验,在体应用中,增强创面电场存在较大难度,而且仅依靠增强电场来促进创面愈合的作用十分有限。首先,控制创面感染和炎症反应是创面优良愈合的必要条件。其次,虽然增强电场可引导表皮细胞定向迁移,但是创面没有良好的愈合微环境和一定程度肉芽生长提供的创基条件,表皮细胞迁移仍不能有效进行。基于以上现状,我课题组设想在创面同时施加NPWT和与内源性电场方向一致的外源性EFs的方法或是解决上述难点的有效手段:NPWT能为创面愈合提供良好的愈合环境,在炎症期,NPWT可有效引流创面渗液、减轻创面炎症反应;在增殖期,NPWT可促进细胞增殖,肉芽增生和血管生成,外源性EFs可指导表皮细胞向创面中心定向迁移,从而加快创面再上皮化进程。但在创缘施加外源性EFs存在较大实施难度,因为创面加电需要的皮肤电极,而目前尚无可用于在创面施加外源性EFs的电极材料:（1）电极缺乏柔韧性,接触皮肤时难以适应皮肤因躯体运动发生的形变;（2）电极不具备化学稳定性,易被创面渗液腐蚀而产生毒副降解产物;（3）电极缺乏良好的导电性,电传导不稳定,电阻过高产生电热反应影响创面愈合;（4）电极缺乏良好的生物相容性,本身和其产生的少量降解副产物会引起机体强烈的免疫反应;（5）电极非多孔结构,影响NPWT的负压抽吸作用;（6）电极不能够长时间稳定固定于创缘和创面中心。制备具有电化学性能稳定的三维多孔结构创面柔性电极或是负压联合外源性EFs的关键技术手段:（1）柔性电极可适应皮肤较大形变;（2）三维多孔结构保留负压引流作用;（3）电化学稳定性可使施加的外源性电场强度稳定。制备柔性电极的关键是将导电组分和柔性聚合物基体进行有效结合,使最终制得的材料在一定应力的多次循环作用下,其电学性能不会出现疲劳和显著下降。在新型导电材料中,超长径比的银纳米线（silver nanowires,AgNWs）用于制备创面柔性电极优势明显:（1）AgNWs除具有银优良的导电性之外,纳米材料的尺寸效应形成的导电渗流网络具有优良的柔韧性和耐曲绕性;（2）在拉伸形变下,长径比的AgNWs在复合材料中的间距比短纳米线增大慢,因而导电通路减少慢,所以具有更强的导电应变稳定性。综上,超长径比的AgNWs是制备创面柔性电极理想的导电组分。在柔性基体的选择方面,现有的NPWT中用于填充创面的聚氨酯（polyurethane,PU）泡沫海绵为疏水性材料,结构疏松、孔径较大,具有良好柔韧性和生物相容性、可以作为支撑三维导电网络的骨架,是合适的柔性基底材料。此外,以PU为基材的改性方式,能够最大程度保留NPWT原有引流作用不受影响。基于以上研究思路,我们设想以超长径比的AgNWs作为导电组分、多孔PU泡沫作为柔性基体,研发3D多孔柔性导电泡沫敷料。基于此导电敷料构成负压联合外源性EFs的“一体化”治疗系统,用于创面治疗。研究目的基于慢性创面治疗的难点和研究现状,我们提出研发3D多孔柔性导电泡沫敷料,以构建“负压联合外源性电场一体化”创面治疗系统,以期显著促进慢性难愈性创面愈合。研究内容与方法:1.构建柔性多孔导电敷料以直径为70 nm,长度为100～200 μm的超长径比AgNWs为导电组分,多孔聚氨酯（PU）泡沫作为支撑导电网络的柔性聚合物基体,制备具有导电引流双功能的创面柔性导电敷料;再用NaBH4处理,去除AgNWs表面聚乙烯吡咯烷酮（PVP）配体;全氟辛基三乙氧基硅烷（1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltriethoxysilane,TPFS）对材料进行疏水涂层修饰以提高其电化学稳定性。最后,制得导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU。2.材料表征扫描电镜（SEM）分析TPFS-AgNWs-PU表面形貌、尺寸及改性修饰后孔隙大小;测量导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU的电阻大小与压缩体积的变化关系;测量TPFS疏水修饰前后TPFS-AgNWs-PU的水接触角;能量色散谱（EDS）分析导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU表面的元素分布;X射线光电子能谱（XPS）分析导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU中元素价态;万有力学测试仪测量导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU的应力-应变曲线。3.导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU细胞毒性电感耦合等离子质谱（ICP-MS）检测TPFS-AgNWs-PU在PBS中Ag的释放量及释放形式;活/死细胞染色和CCK-8细胞实验检测导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU的生物相容性。4.构建NPWT联合外源性EFs的“一体化”创面治疗系统以导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU为导电部分,普通PU敷料为绝缘部分,根据创面形状大小组装后填充创面,以此施加的强度为+100 mV/mm外源性EFs（与创面内源性EFs方向相同,由创缘指向创面中心）;同时连接负压引流装置,对创面施加75 mm Hg的负压。5.评估创面治疗效果以巴马香猪全层皮肤损伤创面为动物模型,以残余创面面积百分比、新生上皮长度为指标,评估NPWT联合外源EFs“一体化”创面治疗系统的促愈作用,并从表皮细胞增殖、迁移和血管生成作用方面研究该治疗系统可能的促愈机理。研究结果1.PU经过7次AgNWs喷涂后,电阻由1156 Ω降至24.5 Ω,且在体积压缩形变83.3%时,可获得3.8 Ω超低电阻值。2.导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU在PBS中7天Ag+释放量为5.2 μg/mL;活/死细胞染色结和CCK-8检测结果显示,导电泡沫敷料TPFS-AgNWs-PU浸提液的相对细胞增值率（RGR）80%,细胞毒性等级为1,安全等级。3.TPFS-AgNWs-PU/EF组（实验组）在施加强度为+100mV/mm的外源性EFs后,创缘EFs总强度值接近+200 mV/mm,且在连续7 d实验组的创缘EFs总强度均较TPFS-AgNWs-PU组（对照组）和空白组高80～100 mV/mm。4.创面形成第7d,实验组未愈创面率30.30±1.75%;对照组61.94±3.86%;空白对照组72.54±3.89%。在第14 d时,实验组未愈创面率3.07±1.23%,18.35±3.83%,空白对照组25.82±3.52%。5.创面形成第7 d时,实验组的新生上皮长度3.94±0.26 mm;对照组3.29±0.32 mm,空白对照组1.59±0.34 mm;第14 d时,实验组新生上皮长度10.23±1.01 mm,对照组 7.29±0.34 mm;空白对照组 6.68±0.41 mm。6.创面形成第7d,实验组的炎症细胞数为27±4个,对照组为61±6个,空白对照组为152±8个。7.在创面形成第7 d时,实验组组Ki67阳性表达率是对照组的1.23倍,空白对照组的2.03倍;第14 d时,实验组组Ki67阳性表达率是对照组的1.31倍,是空白对照组的2.42倍。8.创面形成第7 d时,实验组E-cadherin表达水平较对照组低62.99%,较空白对照组低39.88%;在第14 d时,实验组组E-cadherin表达水平较对照组低65.50%,比空白对照组低52.32%。9.第7 d western blot结果显示,相较于对照组和空白组,实验组的创面组织中PI3K和Akt的表达保持稳定,pPI3Kp85和pAkt表达上调。10.创面形成第7 d时,实验组CD31+血管阳性染色率是对照组的2.43倍,空白对照组的4.06倍;第14 d时,实验组CD31+阳性血管染色率是对照组的2.34倍,空白对照组的3.21倍。研究结论:本研究采用超长径比AgNWs作为导电组分,多孔PU泡沫敷料作为柔性基体,研发了多孔导电柔性泡沫敷料（TPFS-AgNWs-PU）。通过TPFS-AgNWs-PU构建的“一体化”创面治疗系统,可对创面同时稳步施加负压和与创缘内源性EFs方向相同的外源性EFs。以巴马香猪全层皮肤损伤创面为动物模型研究“一体化”治疗系统的促愈效果及机理:“一体化”治疗系统能够显著促进创面再上皮化,加速创面愈合;通过减轻创面炎症反应,刺激VEGF分泌诱导血管生成,激活PI3K/Akt信号促进表皮细胞增殖和迁移,是“一体化”治疗系统促进创面愈合的潜在机理。