第一章弥漫性大B细胞淋巴瘤源性外泌体对巨噬细胞极化的作用及机制研究研究背景弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuselarge B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的成人非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有初诊NHL患者的25%-30%。DLBCL包括多种亚型,其在临床表现、免疫表型及分子遗传学等方面具有高度的异质性。以R-CHOP为主的一线化疗方案显著提高了 DLBCL患者的治疗效果,但仍有约40%的患者疗效不佳,甚至转变为难治/复发DLBCL。因此,探究DLBCL的发生发展机制,为DLBCL寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。肿瘤免疫逃逸是肿瘤细胞通过改变自身或微环境来逃避机体的免疫监视,免疫逃逸与DLBCL的进展、预后不佳密切相关。其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境中免疫细胞的主要组分。巨噬细胞在不同的刺激下可以分化成不同的亚型,主要包括发挥抗肿瘤效应的M1型和促肿瘤效应的M2型。M2型巨噬细胞分泌多种免疫抑制性细胞因子,促进肿瘤细胞的生长,抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤功能。TAMs的浸润丰度常常预示着患者的不良结局。研究表明,DLBCL中巨噬细胞向M2极化。因此,巨噬细胞M2极化诱导的免疫逃逸可能是DLBCL发病机制之一。外泌体（extracellular vesicles,EVs）是哺乳动物细胞分泌产生的一种直径为30-150nm的细胞外囊泡,包含大量来自母体细胞的组分如蛋白质、脂质、非编码RNA等活性物质介导细胞间的信息传递。在多种实体瘤及血液系统肿瘤中,肿瘤源性外泌体通过递送各种信号物质来调控巨噬细胞的极化与重编程,从而导致肿瘤免疫逃逸与进展。但DLBCL源性外泌体对巨噬细胞极化的调控作用及机制尚不清楚,本课题拟研究DLBCL来源的外泌体对巨噬细胞极化及功能的影响,探索该过程在DLBCL发生发展中的作用。研究目的探究DLBCL来源的外泌体对巨噬细胞表型和功能的调节作用,为DLBCL患者治疗提供新靶点,有望提高患者的预后。研究方法1.外周血标本收集、处理与检测:收集36例初诊DLBCL患者和40例健康对照者外周血标本,利用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。流式细胞术检测两组样本外周血中CD163+细胞的比例。2.细胞系培养、外泌体的提取及鉴定:体外培养DLBCL细胞株RC和人白血病细胞系THP-1,差速离心法提取分离DLBCL细胞株培养上清中的外泌体,粒径分析外泌体的颗粒特性,Western blot定量分析外泌体相关蛋白表达情况。3.巨噬细胞的极化:将诱导后的巨噬细胞与DLBCL细胞株来源的外泌体共培养,流式细胞术检测外泌体对M2型巨噬细胞极化相关分子CD163表达水平的影响;RT-qPCR 检测 CD206、CD163、IL-10、TNFα、iNOS 的表达水平。4.细胞增殖、凋亡检测:CCK8法检测与M2巨噬细胞共培养后的DLBCL细胞增殖速度,流式细胞术检测M2巨噬细胞对DLBCL细胞凋亡的影响。5.统计分析:使用GraphPad prism 9软件对实验数据进行统计分析,数据以平均值±标准差表示,所有数据为至少三次独立重复实验的结果,使用Student t检验或Mann-Whitney检验分析组间差异。P值小于0.05差异具有统计学意义。研究结果1.与健康对照者相比,初诊DLBCL患者外周血中CD163+细胞比例显著增加。2.差速离心法提取的沉淀物粒径分析显示:微粒直径在30-150nm之间;Western blot结果显示表达外泌体标志蛋白CD63和TSG-101,而不表达非外泌体蛋白calnexin,证实DLBCL细胞培养上清提取物为外泌体。3.显微镜下诱导后的巨噬细胞呈长梭形、贴壁状态,细胞停止分裂增殖。4.流式细胞术检测发现:外泌体会促进巨噬细胞CD163的表达,RT-qPCR分析结果也发现肿瘤源性外泌体会上调CD206、CD163、IL-10的mRNA表达,下调TNFα的表达,而对iNOS的mRNA水平调控不明显。说明DLBCL源性外泌体促进巨噬细胞向M2型极化。5.CCK8法分析结果显示:外泌体极化后的M2巨噬细胞促进DLBCL细胞的增殖速度,流式细胞术检测显示外泌体极化后的M2巨噬细胞减少DLBCL细胞的凋亡比例。结论我们的研究初步发现DLBCL来源的外泌体促进巨噬细胞向M2极化,通过调控DLBCL的免疫逃逸微环境,促进肿瘤进展。这为DLBCL的发生发展机制研究提供了免疫学基础,为DLBCL的临床诊断和治疗提供了新的生物标记物,表明靶向DLBCL外泌体的新型治疗策略可能改善DLBCL患者的临床治疗效果。第二章CDH23在急性髓系白血病免疫浸润及预后中的作用研究背景急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤,表现为骨髓原始细胞的克隆性扩增,通常伴有贫血,疲劳以及出血和感染风险增加。目前,AML的发病仍不清楚,基因突变、化学品暴露、辐射等都是可能的致病危险因素。虽然近年来对AML的生物学过程有了更清晰的了解,但它仍然是最致命的恶性肿瘤之一。AML患者缓解率相对较低,成人AML患者的5年生存率不到30%。因此,探索新的治疗靶点对提高AML患者预后及降低患者死亡率具有极其重要的意义。钙粘蛋白超家族在人类中有超过100个家族成员,参与信号转导、自我识别和肿瘤抑制等生理过程。该超家族成员蛋白均有一个约110个氨基酸大小的胞外钙粘蛋白结构域。该结构域存在串联重复,参与介导钙结合和与其他钙粘蛋白分子的相互作用。钙粘蛋白23（cadherin-23,CDH23）是该家族中的一种非典型钙粘蛋白。研究发现,CDH23通过介导细胞间的粘附参与多种肿瘤进展,DLBCL中CDH23表达下调提示预后不佳。然而,CDH23在AML的中的表达情况、生物学功能和肿瘤微环境的相互作用未见报道。研究目的1.探究CDH23在AML中的表达水平以及预后价值,为AML患者的早期诊断、预后评估以及发病机制研究提供分子基础。2.探讨CDH23对AML中免疫细胞浸润和肿瘤微环境的影响,进一步探讨其参与AML疾病进展的信号通路及分子机制,为AML提供新的治疗靶点。研究方法1.研究对象的选择:提取TCGA数据库145例AML患者骨髓组织样本RNA表达谱和临床信息作为训练队列,提取Beat AML数据库139例AML患者作为验证队列,统计分析两组队列中的患者临床信息、遗传细胞学及分子生物学信息。2.根据CDH23mRNA表达量的中位数值将患者分为高低表达组,Spearman秩相关分析CDH23的表达与AML临床特征的相关性。3.利用GEPIA数据库分析比较CDH23在AML患者及健康对照者骨髓组织样本中的表达水平,通过Kaplan-Meier工具绘制生存分析曲线,探索CDH23表达水平与AML患者总体生存期的关系,利用单因素和多因素Cox回归分析CDH23以及患者的临床信息、遗传细胞学及分子生物学信息在AML中的预后意义。4.采用LinkedOmics分析CDH23表达相关基因及其预后价值,使用TIMER数据库分析CDH23与不同免疫浸润细胞浸润类型及丰度的相关性以及与肿瘤微环境的相关性。5.利用LinkedOmics进行GO和KEGG富集分析CDH23可能参与的生物学过程及分子功能,进一步通过GeneMANIA探讨该基因在AML中发挥作用可能的信号通路。6.统计分析:利用R语言（4.0.1版本）统计分析数据。数据均以平均值±标准差表示。应用Mann-Whitney U检验分析组间差异。P值小于0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.CDH23的表达值与年龄和遗传危险分层有关,而与其他临床病理特征无显著相关性。2.CDH23在AML患者骨髓组织样本中显著高表达,与患者总体生存期负相关。3.单因素和多因素cox回归分析显示CDH23表达水平、年龄和遗传危险分层是影响AML生存的独立预后因素。4.CDH23的表达与AML免疫浸润微环境中单核细胞、记忆活化CD4+T细胞、调节性T细胞浸润水平正相关,而与初始B细胞、嗜酸性粒细胞、静息肥大细胞、浆细胞、静息记忆CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润比例负相关。CDH23的表达水平与免疫得分和基质得分呈正相关。5.CDH23通过参与破骨细胞分化、吞噬体形成、溶酶体产生、趋化因子信号通路,内吞作用,NOD样受体信号通路,肌动蛋白细胞骨架的调节等信号通路来介导AML发生发展。结论本研究发现CDH23在AML患者中表达上调,且与患者不良预后负相关,证实CDH23是预测AML患者临床结局的一个独立预后因子。CDH23的表达影响AML微环境中的免疫细胞浸润类型及丰度,参与肿瘤免疫抑制微环境的形成。CDH23通过参与肌动蛋白细胞骨架的调节等途径调控肿瘤的免疫应答以及进展过程。综上所述,CDH23可能作为AML的预后生物标志物,且有望成为治疗AML的新靶点。