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水稻是世界性重要的粮食作物,是我国40%左右粮食的来源。水稻生长受多种胁迫因素的影响,其中水资源短缺和土壤盐渍的影响严重制约了水稻的生产总量。利用基因工程手段,提高水稻的耐盐抗旱能力具有深远的应用前景。农杆菌介导法是目前普遍应用的水稻转基因方法,水稻品种间遗传差异很大,农杆菌介导法对植株再生和遗传转化的基因型依赖也很大。本研究以宁夏9种水稻品种为试验材料,建立了宁夏水稻成熟胚的高频再生体系,探索并优化了农杆菌介导的宁夏水稻遗传转化条件及其影响因素,利用农杆菌法将SOS1-SOS2-SOS3-CBL10-BAR基因(简称KEGT-A基因)转入宁夏水稻,对获得的宁夏水稻KEGT-A转化植株进行分子检测,研究结果如下:
1.建立并优化了宁夏水稻成熟胚的高频再生体系,筛选出了离体培养再生特性较好的宁夏水稻基因型。研究表明,参试的9个宁夏水稻品种成熟胚的培养特性差异很大,愈伤组织诱导率在23.89%~71.33%之间;其中宁粳23成熟胚表现出良好的培养特性,愈伤组织诱导率和绿苗分化率分别为71.33%和77.16%。诱导愈伤组织的最佳培养基:N6+2,4-D2mg/L+ABA2mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+L-脯氨酸0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L(pH5.8),在此培养基中诱导的愈伤组织继代能力强,且诱导率高。愈伤组织最佳分化培养基:MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+ZT0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+L-脯氨酸0.5g/L+蔗糖30g/l+琼脂粉7g/L(pH5.8)。研究发现成熟胚愈伤组织在继代1~2次,周期为14d时分化培养效果最佳,继代时间超过14d以上,愈伤组织逐渐变得灰暗、无光泽、生长缓慢、分化能力显著降低。
2.建立并优化了农杆菌介导的宁夏水稻成熟胚愈伤组织遗传转化体系。以宁粳23成熟胚愈伤组织为转化受体,研究结果表明:转化的愈伤组织共培养3d,然后转接于N6+2mg/L2,4-D+0.5g/L水解酪蛋白+0.5g/L L-脯氨酸+5mg/L PPT+250 mg/L cef30g/L蔗糖+7g/L琼脂,pH5.8的培养基中。Cef的浓度大于500mg/L时明显抑制了愈伤组织的生长,Cef浓度为250mg/L的时抑制农杆菌的繁殖,最适合转化愈伤组织生长,获得的抗性愈伤组织分化率最高。
3.通过对宁夏水稻成熟胚再生体系的建立和农杆菌法转化水稻的研究,建立起了一个有效的宁夏水稻KEGT-A(SOS1-SOS2-SOS3-CBL10-BAR)多基因遗传转化体系。以宁粳23成熟胚诱导的愈伤组织为受体,经农杆菌介导和除草剂的抗性筛选,共获得了37个转基因植株。经PCR分子检测,有3株分别在700bp(SOS1)、550bp(SOS2)、683bp(SOS3)、460bp(CBL10)、463bp(BAR),处有特异性扩增条带,初步证明KEGT-A多基因已整合到宁粳23号水稻的基因组中。