论文部分内容阅读
许多眼科疾病均是在视神经损伤后发生了以视网膜神经节细胞（Retinal GanglionCell，RGC）不可逆性凋亡或坏死为主的变化，进而导致视神经传导通路的中断。作为中枢神经的代表，视神经的损伤和再生机制近年来得到深入而广泛的研究。视神经在损伤后或者在周围神经病变中不能再生是目前临床上亟待解决的问题之一。视网膜神经节细胞轴突形成视神经后能够将所有视觉信息传递给神经中枢，但是在视神经损伤后，由于视网膜神经节细胞不可逆性死亡造成视神经不能再生，进而导致视力永久性丧失。醛糖还原酶（Aldose Reductase，AR）属于还原型辅酶II（Nicotinamide Adenosine Dinucleotide Phosphate-Hependent，NADPH）依赖型醛酮还原酶家族[1]。醛糖还原酶是葡萄糖代谢多元醇通路中的重要限速酶[2]。近来有学者随着对于AR功能研究的不断深入研究发现，无论在高血糖状态下还是在血糖正常的情况下，AR在介导生长因子、细胞因子以及化学信号的传导过程中都发挥着重要的作用[3]。本课题研究对象为AR，重点研究AR在视神经损伤后随时间的变化情况；AR对视神经损伤后存活和再生的作用及影响，探讨视神经损伤后AR的表达情况及AR对视网膜神经节细胞存活和再生的影响。本研究由以下两部分实验组成：实验的第一部分是研究AR在小鼠视神经损伤后的表达变化情况。该部分实验主要是应用C57BL/6-AR+/+（野生型）小鼠，建立小鼠视神经横断（Optic NerveTransaction，ONT）模型[4]，野生型小鼠分组后分别进行视神经横断损伤的手术及仅分离暴露视神经眶内段的假手术处理，分别选取小鼠视神经横断组及假手术组术后0d、3d、5d、7d、14d共5个时间点，取材收集视神经横断组及假手术组术后不同时间点的视网膜组织提取物，分别应用Western Blot、QPCR等方法检测AR，观察视神经损伤后视网膜AR表达量的变化情况。实验的第二部分是研究AR对小鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞存活的作用及AR对小鼠视神经横断损伤后再生相关蛋白表达的影响。首先用AR-/-小鼠与YFP小鼠交配，鉴定获得AR-/--Thy1-YFP(AR-/-YFP)小鼠。同实验一的方法，建立Thy1-YFP/AR+/+(AR+/+YFP小鼠)小鼠和Thy1-YFP/AR-/-小鼠(AR-/-YFP小鼠)视神经横断损伤的模型，分别选取视神经横断损伤术后3d、7d、14d等三个时间点，取材收集两组对应时间点的眼球组织，应用视网膜冰冻切片技术，荧光显微镜下分别观察计数两组术后3d、7d、14d存活的视网膜神经节细胞的数目。其次，同样建立C57BL/6-AR+/+（野生型）小鼠和C57BL/6-AR-/-（AR基因敲除）小鼠视神经横断模型，分别选取两组视神经损伤术后3d、7d、14d等三个时间点，取材收集对应时间点的眼球组织进行石蜡切片及苏木精-伊红染色（HE染色），分别观察两组存活的视网膜神经节细胞情况。最后利用野生型小鼠和AR基因敲除建立小鼠视神经横断模型，分别选取两组视神经损伤术后0d、3d、5d、7d、14d等五个时间点，取材收集对应时间点的视网膜组织，利用Western Blot的方法分别检测两组神经生长相关蛋白（Growth-associated protein-43，GAP-43）的表达变化情况。通过以上的实验结果，我们发现第一部分实验中通过Western Blot方法检测小鼠视神经横断组及假手术组术后不同时间点的视网膜AR表达量的变化情况。结果显示：假手术组AR的表达量并未随着损伤时间的增加而发生明显的变化，而视神经横断组的AR表达量随着损伤时间逐渐升高，并在损伤后第7d达到高峰，并且QPCR结果与其结果趋势一致。实验第二部分中，AR+/+YFP小鼠和AR-/-YFP小鼠视神经横断损伤手术后，通过视网膜冰冻切片，荧光显微镜下分别观察计数两组术后对应时间点存活的视网膜神经节细胞的数目。AR-/-和野生型小鼠视神经横断损伤手术后，通过HE染色分别观察计数两组术后对应时间点存活的视网膜神经节细胞的数目。结果显示：随着损伤时间的增加，两组存活的视网膜神经节细胞数目都逐渐的减少，在损伤后3天，野生型小鼠组和AR敲除小鼠的视网膜节细胞数量没有明显变化；但从损伤后的第7天开始，AR敲除小鼠组存活的视网膜神经节细胞明显多于野生型小鼠组。AR-/-和野生型小鼠视神经横断损伤手术后，通过Western Blot方法分别检测术后视网膜节细胞存活情况及视网膜GAP-43表达量的变化情况。结果显示：随着损伤时间的增加， GAP-43的表达量逐渐升高，术后第7d达到高峰，并且AR基因敲除小鼠组与野生型小鼠组在损伤后的同一时间点，对比观察到从损伤后第7d开始AR基因敲除小鼠组的GAP-43表达量明显高于野生型小鼠组。通过上述研究我们发现：野生型小鼠视神经横断损伤后随着损伤时间AR表达量逐渐升高，说明AR参与了视神经损伤后的反应过程；AR-/-YFP小鼠存活的视网膜神经节细胞数目在术后同一时间点明显多于AR+/+YFP小鼠，提示AR可能参与调节促进视网膜神经节细胞的存活过程；AR-/-小鼠视神经横断损伤后GAP-43表达量在术后第7d升高并且从术后第7d开始AR-/-小鼠组GAP-43表达量明显高于野生型小鼠，说明AR可能参与影响了视神经损伤后再生的调节过程。