人体由于细胞分化、发育、感染、衰老等原因,体内每天产生数以十亿计的凋亡细胞(1)。细胞凋亡是一个消耗能量的生物学过程,如果凋亡细胞没有被及时清除,凋亡细胞会发生二次坏死(2)。发生二次坏死的凋亡细胞不能维持细胞膜的完整性,导致其细胞膜会破裂从而释放细胞内容物如自身抗原。正常情况下体内的凋亡细胞能够被巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞等专职和非专职吞噬细胞及时有效地吞噬清除,以防止细胞内自身抗原等内容物的释放和机体自身免疫应答的激活(3)。因而吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除对于维持机体内环境的稳态具有十分重要的意义。系统性红斑狼疮(SLE)是累及皮肤、肾脏、心血管和神经等多个组织和器官的慢性自身免疫性疾病(4)。SLE患者外周血中有大量针对自身抗原的自身免疫性抗体如抗核抗体(ANA)和抗DNA抗体(ADA)。研究表明对凋亡细胞吞噬清除障碍是SLE发病的重要原因之一(5),SLE患者体内巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力较健康人显著降低,而同时体内有大量未被及时吞噬清除的凋亡细胞积累(4,6-9)。凋亡细胞细胞能够释放“find me”信号分子以有效的募集吞噬细胞(10)。研究表明凋亡细胞能够通过caspase依赖的方式激活鞘氨醇激酶(Sphk),后者能合成S1P。凋亡细胞释放的S1P作为“find me”信号分子(11),通过巨噬细胞表面表达的S1P受体1(S1PR1)诱导巨噬细胞向凋亡细胞的定向趋化作用(12)。研究表明在SLE患者外周血单个核细胞和自发性红斑狼疮Faslpr/lpr小鼠的脾脏中,S1PR1的m RNA和蛋白表达水平均显著低于正常对照(13)。提示“find me”分子S1P在凋亡细胞清除和SLE发病中起着重要作用。除了分泌和释放“find me”分子,凋亡细胞表面还提供“eat me”信号分子给巨噬细胞识别,因而巨噬细胞能够识别并吞噬凋亡细胞而非正常的活细胞(10)。目前研究最广泛的“eat me”信号分子是磷脂酰丝氨醇(PS)(14)。PS是细胞膜的组成成分之一,正常细胞中PS定位在细胞膜脂质双分子层的内侧面,只有当细胞凋亡时PS才外翻至细胞膜的外侧面,阻断凋亡细胞表面的PS能够阻断巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。除此之外,巨噬细胞自身能够合成分泌某些蛋白分子以识别并结合PS,例如乳脂肪球表面生长因子8(MFG-E8)和生长停止特异性蛋白6(Gas6)(34)。MFG-E8能够与PS结合,并通过整合素介导巨噬细胞对ps的识别。血浆中的gas6能够结合凋亡细胞表面外翻的ps,而与巨噬细胞上的酪氨酸激酶受体mer结合,从而介导巨噬细胞对ps的识别与结合(16)。研究表明,mfge8缺陷的小鼠出现年龄依赖的sle自身免疫表型,体内产生高浓度的ana和ada,而mer缺陷的小鼠也会出现系统性红斑狼疮样的自身免疫性症状。这些结果均说明凋亡细胞吞噬清除障碍是机体自身免疫性疾病的重要原因之一(17)。激素类糖蛋白分子促红细胞生成素(epo)是促进机体造血过程的重要调控因子。epo下调红细胞前体细胞上的fasl/fas表达而抑制未成熟红细胞的凋亡,增加外周血成熟红细胞的数量促进机体造血功能。最近的研究表明,epo还具有炎症调控功能(21-22)。在我们之前的报道中epo能够抑制大鼠实验性自身免疫性神经炎的炎症因子表达和炎症细胞的浸润,具有显著的治疗作用(23)。研究发现巨噬细胞表达促红细胞生成素受体(epor)并且是epo调控炎症的重要靶细胞。epo能够通过抑制巨噬细胞在lps和ifn-γ等炎症刺激下nf-κb的活化而抑制tnf-α,il-6和il-12等促炎因子的表达与释放(24)。此外研究发现epo能够促进人外周血单核巨噬细胞对细菌和颗粒物的吞噬(25)。在小鼠模型中,向野生型c57bl/6小鼠腹腔注射epo后其腹腔巨噬细胞对细菌和颗粒物的吞噬率显著增加(26)。在epo过表达的转基因tg6小鼠中研究也发现腹腔巨噬细胞对细菌和颗粒物的吞噬显著高于野生型小鼠。在tg6小鼠中进一步研究表明tg6小鼠巨噬细胞对红细胞的吞噬能力显著高于野生型小鼠(27),而巨噬细胞对红细胞的吞噬机制与凋亡细胞吞噬类似,都是ps外翻、mer介导的吞噬过程(29),因而上述结果提示epo能够促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用(28)。临床研究提示sle患者中epo/epor信号通路的功能障碍与sle疾病严重度有密切联系。研究发现sle患者外周血中epo的浓度显著低于健康人(29),46%的sle患者外周血中检出抗epo抗体,且抗epo抗体阳性的sle患者其体内抗双链dna滴度显著高于抗epo抗体阴性的sle患者,提示sle病人中epo信号通路的功能不足与sle自身免疫性反应的潜在关联(30)。除了抗epo抗体,研究发现sle患者中还存在抗epor抗体,抗epor抗体阳性的sle患者其抗双链dna抗体和疾病活动度均较高(31)。另一研究证实sle患者血清中的抗epor自身抗体能够中和体内epo活性。上述临床研究结果均提示sle患者体内epo/epor信号通路功能障碍,且抗epo/epor抗体与患者自身免疫性严重程度呈正相关。我们的研究表明,凋亡细胞释放的“findme”分子s1p能够诱导巨噬细胞epo/epor通路的表达和活化。epo/epor通过诱导巨噬细胞pparγ的表达促进其对凋亡细胞的吞噬。巨噬细胞epor条件性敲除后对凋亡细胞的吞噬显著降低,相应的epor-cko小鼠出现年龄依赖的凋亡细胞累积和系统性自身免疫性症状,具体而言我们做了以下工作。在第一部分的研究中,体外实验发现凋亡细胞条件化培养基和s1p诱导小鼠腹腔巨噬细胞hif-1α、epo、epor和p-jak2的表达,而缺乏s1p的凋亡细胞条件化培养基不具有诱导巨噬细胞epo/epor通路表达的作用,阻断巨噬细胞s1pr1能够抑制凋亡细胞培养基和s1p的上述作用。体内实验中发现注射外源性凋亡细胞培养基和s1p体内通过s1pr1诱导巨噬细胞epo/epor信号通路的表达以及活化。使用注射地塞米松诱导内源性细胞凋亡能够在体内通过s1pr1诱导巨噬细胞epo/epor信号通路的表达以及活化。生理条件下阻断s1pr1或阻断细胞凋亡后小鼠脾脏epo水平和脾脏巨噬细胞epor的表达均显著降低。以上结果表明凋亡细胞释放的s1p通过s1pr1诱导巨噬细胞epo/epor通路的表达和活化。第二部分我们研究了epo/epor通路对巨噬细胞吞噬凋亡细胞的调控作用。体外研究结果表明,epor敲除后小鼠巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬显著降低,而外源性rhepo促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。体内注射凋亡细胞后检测发现巨噬细胞条件性epor敲除小鼠腹腔巨噬细胞和脾脏巨噬细胞对凋亡细胞的体内吞噬显著降低,而外源性rhepo促进wt小鼠腹腔巨噬细胞和脾脏巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。生理条件下epor-cko小鼠脾脏巨噬细胞吞噬凋亡细胞的比例显著低于野生型小鼠。以上结果证明epo/epor通路促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的调控作用。炎症因子检测发现rhepo抑制巨噬细胞tnf-α,il-6,mcp-1的分泌,促进tgf-β分泌,而epor-ko腹腔巨噬细胞吞噬凋亡细胞后分泌较多tnf-α,il-6,mcp-1和较少的tgf-β。我们在55周龄的老年epor敲除小鼠脾脏、外周血、胸腺、肾脏等组织中观察到凋亡细胞的积累显著增加,进一步表明epor-cko小鼠中巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除能力是下降的。第三部分研究结果显示rhepo能够显著诱导巨噬细胞pparγ的表达水平,epor-cko小鼠腹腔巨噬细胞pparγ的表达显著降低。rhepo不能促进pparγ-cko小鼠巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,而pparγ激动剂能够促进epor-cko小鼠巨噬细胞巨噬凋亡细胞,表明rhepo促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞通过pparγ途径。此外研究发现rhepo能够诱导野生型小鼠巨噬细胞而非pparγ缺陷巨噬细胞mfge8,mertk,cd36和gas6等与吞噬凋亡细胞相关的基因表达,进一步表明epo通过上调pparγ促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞。第四部分研究结果表明凋亡细胞培养基中的S1P能够诱导巨噬细胞PPARγ表达显著增加,S1P和凋亡细胞培养基能够诱导野生型小鼠巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,而不能促进EPOR-c KO和PPARγ-c KO小鼠巨噬细胞吞噬凋亡细胞。S1P能诱导野生型小鼠腹腔巨噬细胞Mfge8,Mertk,CD36和Gas6的表达,而不能诱导EPOR-cKO小鼠巨噬细胞上述分子表达的增加,进一步表明S1P通过EPO/EPOR促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞。第五部分我们研究EPOR-c KO小鼠年龄依赖的SLE样自身免疫性改变。研究发现40和55周龄EPOR-cKO小鼠血清抗双链DNA,抗核抗体,抗Sm抗体显著高于对照。55周龄EPOR-cKO小鼠肾脏沉积大量的Ig G、Ig A和C3,同时出现蛋白尿等肾功能受损的特征。此外在55周龄的EPOR-c KO小鼠皮肤中出现明显的Ig G沉积,肺部B细胞和巨噬细胞浸润显著,外周血促炎因子IL-6、MCP-1、TNF-α、IFN-α和IFN-β与野生型小鼠相比显著增加,而炎症抑制因子TGF-β表达显著降低。以上结果表明EPOR-cKO小鼠出现年龄依赖的SLE样自身免疫性疾病。第六部分中,使用rhEPO治疗降植烷诱导的小鼠SLE模型(33),EPO治疗后SLE小鼠巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力显著上升,小鼠体内凋亡细胞的显著减少。EPO治疗降低了SLE小鼠外周血抗核抗体和抗双链DNA抗体滴度,减少了SLE小鼠肾脏Ig G沉积,降低了小鼠血清炎症因子IL-6、MCP-1和TNF-α水平,而炎症抑制因子TGF-β水平在治疗后增加。进一步研究结果显示PPARγ激动剂罗格列酮能够显著降低EPOR-cKO小鼠自身免疫严重程度,而rh EPO对PPARγ-c KO小鼠的自身免疫性症状治疗无效,说明EPO/EPOR信号通路通过下游PPARγ途径其作用。综上所述,我们的研究表明凋亡细胞释放的S1P通过S1PR1诱导巨噬细胞HIF-1α表达,HIF-1α进一步诱导EPO/EPOR通路的表达与活化。EPO/EPOR通过诱导巨噬细胞PPARγ表达从而促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。在EPOR-c KO小鼠中,EPOR敲除的巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力降低,小鼠出现年龄依赖的凋亡细胞积累和SLE样的系统性自身免疫性症状。