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细胞核因子-κB（NF-κB, p65/p50）信号通路在病毒感染与疾病发展过程中发挥重要作用,直接调控宿主先天性免疫反应及细胞增殖、分化和凋亡,NF-κB活化异常可能是PRRSV感染导致免疫抑制的重要原因。为获得猪NF-κB p65、p50两亚基基因序列特征及探讨NF-λB表达异常是否与PRRSV感染导致的免疫抑制有一定的相关性。本试验通过NCBI GeneBank中猪核转录因子p50前体蛋白的基因序列（NM001048232）、p65（RelA）序列（NM001114281）设计特异性引物分别对NF-κB p65ORF区、成熟p50编码区及p50-RHD区进行克隆、序列鉴定、原核及真核表达、重组蛋白纯化和多克隆抗体制备；对PRRSV感染Marc145细胞NF-κB p65/p50mRNA转录时相、核易位（即活化程度）进行分析：并探讨NF-kB p65/p50原核及真核表达产物对PRRSV复制的影响,结果如下：1.猪核转录因子NF-κB p65/p50两亚基基因的克隆及序列鉴定采用RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增到NF-κB p65ORF区和成熟p50编码区、p50-RHD区,克隆至pMD19T simple vector,对阳性克隆进行序列测定,并进行相关生物信息学分析。序列分析结果表明：所扩增猪NF-κB p65亚基ORF长1662bp,编码553aa,p50成熟蛋白编码区长1653bp,编码551aa; p50-RHD长777bp,编码259aa。猪p65、p50核苷酸序列与不同动物的p65、p50核苷酸序列相似性较高；p65大部分位于细胞核（56.5%）内,p50绝大部分存在于细胞质中（78.3%）,均无信号肽及跨膜区。2.猪核转录因子NF-κB p65/p50两亚基基因的原核表达及多克隆抗体的制备将扩增出P65ORF区、成熟p50编码区克隆至pET21a（+）中,p50-RHD克隆至pET32a（+）中,转化至Rostta感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blot对表达产物进行鉴定；将纯化复性蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用琼脂扩散试验对多克隆抗体进行检测。结果表明成功构建了大量以包涵体形式表达Mr均约为70KD的p65／p50融合蛋白的p65/p50-pET21a（+）原核表达载体及大量以包涵体形式表达Mr约为45KD的p50-RHD-pET32a（+）原核表达载体；Western-Blot显示p50、p65重组蛋白可分别与兔抗人p50多克隆血清、兔抗人p65纯化抗体反应；所制备的兔抗p65、兔抗p50-RHD、兔抗p50血清琼扩抗体滴度分别为1：8、1：16、1：32。3. PRRSV感染Marc145细胞NF-κB p65/p50两亚基基因mRNA转录时相及核易位的影响分析运用实时荧光定量PCR技术对PRRSV感染Marc-145不同时期NF-κB p50、p65mRNA的转录水平变化进行定量分析,并提取不同感染时期Marc-145细胞核蛋白,利用免疫印迹法检测细胞核内具有活性的p50、p65水平变化。荧光定量结果表明：Marc-145感染PRRSV8-12h,p50、p65转录水平急剧下调,12-120h p50、p65mRNA含量一直维持在较低水平,与接毒前及对照组同时期的转录水平相比,差异极显著（P<0.01）。免疫印迹结果表明,Marc-145感染PRRSV12-96h,细胞核内均未检测到p50的表达；感染12h,细胞核内p65表达下调,48-96h未检测到p65的表达。4.猪NF-κB p65/p50亚基的原核表达产物对PRRSV增殖的影响将NF-κBp65/p50原核表达产物纯化复性后添加到DMEM细胞维持液中,观察p65/p50对Marc145细胞毒性,确定最佳使用浓度；利用p65/p50最佳浓度研究其对PRRSV体外感染的增殖活力,通过实时荧光定量PCR方法研究PRRSV感染时相,绘制PRRSV增殖曲线。结果表明NF-κB p65/p50可促进PRRSV感染Marc-145CPE出现及病毒早期增殖；CPE出现后,病毒增殖受到抑制,病毒滴度水平显著降低（P<0.05）。5.猪NF-κB p65/p50亚基真核表达载体转染Marc145对PRRSV增殖的影响构建猪NF-κB p50、p65亚基基因的真核表达载体,将两重组质粒单独及同时转染至Marc145中进行表达,测定其对PRRSV增殖的影响。转染p50+p65、p65真核表达质粒都会促进PRRSV感染Marc145CPE出现,加速CPE进程,最终导致PRRSV增殖受到抑制,极大降低病毒滴度水平。其中,p50+p65的抑制作用更强。转染p50真核质粒会推迟PRRSV感染Marc145CPE出现,减缓PRRSV在Marc145细胞上增殖的进程,但对病毒滴度水平影响不大。