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背景：肿瘤转移是恶性肿瘤的重要标志，是大多数癌症患者的主要致死原因。淋巴道转移和血道转移是瘤细胞在机体内播散的两种途径。研究表明大部分恶性肿瘤最初转移并不是通过血管，而是通过淋巴道。肿瘤的淋巴道转移可作为肿瘤转移早期信号；肿瘤淋巴道转移与否也是术前选择最佳治疗方法的关键。但对肿瘤淋巴道转移分子机制的研究较少。小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P来源于同一亲本细胞系，具有相同遗传背景但淋巴道转移力不同。其中Hca-F的淋巴结转移率约为75%，Hca-P的淋巴结转移率约为25%，是研究肿瘤淋巴道转移的理想细胞系模型。膜联蛋白A5（Annexin A5，Anxa5）是膜联蛋白家族（Annexin）的一员，近年来研究表明：Anxa5异常表达与结直肠癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌、宫颈癌等恶性肿瘤密切相关。但Anxa5与肿瘤淋巴道转移的相关研究鲜有报道。我们前期定量蛋白质组学结果发现Anxa5在Hca-F中的表达是Hca-P的3.16倍，并与其在基因水平差异表达一致，提示Anxa5可能是潜在促进肝癌淋巴道转移的靶标分子。本研究通过RNA干扰技术，下调Anxa5基因在高淋巴道转移力细胞株Hca-F中的表达来探索Anxa5与肿瘤细胞淋巴道转移潜能细胞行为的关系。目的：1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa5表达载体，稳定转染至Hca-F细胞，得到Anxa5基因表达下调的Hca-F细胞株。2、明确Anxa5蛋白水平下调后，Hca-F细胞在增殖能力、迁移能力、侵袭能力和细胞周期等方面的变化。方法：1、根据Anxa5在GenBank中的基因序列，针对其基因序列的352位、729位和958位，设计相应siRNA序列，并以无关序列作为阴性对照。构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa5表达载体和无关序列阴性对照载体，并进行测序鉴定。构建好的载体，用阳离子聚合物SofastTM基因转染试剂稳定转染至Hca-F细胞，培养24小时后在荧光显微镜下观察转染效率。转染成功细胞用含400g/ml G418的培养基进行培养和筛选，稳转细胞再进行单克隆的筛选和培养。采用Western blot技术检测筛选成功的各组单克隆细胞、稳定转染无关序列的Hca-F细胞以及Hca-F细胞的Anxa5蛋白表达水平。选出siRNA干扰效果不同，即Anxa5表达水平不同的单克隆细胞株用于后续实验。2、应用CCK-8试剂盒检测各组单克隆细胞株的细胞增殖能力、应用Transwell小室检测各组细胞的侵袭和迁移能力、应用流式细胞仪检测各组细胞的周期，并与无关序列转染Hca-F和正常Hca-F细胞进行比较。结果：1、Anxa5重组质粒测序均与设计序列相同，表明重组质粒构建成功。三组重组质粒共筛选出18株单克隆细胞，其中pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa5-729组的6株单克隆细胞分别命名为1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6；pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa5-958组的6株单克隆细胞分别命名为2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6；pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa5-352组的6株单克隆细胞分别命名为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6。Western blot显示：单克隆细胞株3-3、3-5的siRNA干扰效果最好，其干扰效率约为100%，即Anxa5的蛋白表达水平下降约为100%；其次为单克隆细胞株1-1，其干扰效率约为80.2%；再次为单克隆细胞株2-2，其干扰效率约为63.8%，选1-1、2-2、3-3为后续实验细胞株。2、CCK-8结果显示：Anxa5基因表达下调到一定程度才会抑制Hca-F细胞的增殖能力；Transwell小室结果表明：Anxa5蛋白水平降低会抑制Hca-F细胞的迁移及侵袭能力，并与其表达下调程度相关；流式细胞仪检测结果显示：Anxa5基因表达下调会影响Hca-F细胞的细胞周期。结论：1.成功构建了3个不同靶点的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa5表达载体，获得siRNA干扰效率不同的18株单克隆细胞株；2、Anxa5蛋白水平降低会抑制Hca-F细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并与Anxa5基因表达下调程度相关；Anxa5蛋白表达下调后，Hca-F细胞的G0/G1期缩短，G2/M期延长，即Hca-F细胞G2/M期阻滞。