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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种高度接触传染性疾病。在强毒株感染的情况下,感染家猪的死亡率极高,甚至可达到100%。ASF被OIE规定为法定报告的动物疫病,同时ASF在我国属于一类动物疫病。自2018年8月我国首次确诊ASF,随后ASF疫情在我国多地爆发,沉重打击了我国养猪业。目前临床上对于ASFV的防控仍缺乏安全、有效的疫苗,因此建立快速准确的ASFV诊断方法,对于临床上防控该病极其重要。ASFVp30蛋白是由基因组中开放阅读框CP204L编码的一种结构蛋白,并且在病毒感染早期大量出现。p30蛋白具有良好的抗原性,是一种理想的免疫学检测抗原。本研究通过构建ASFV p30蛋白的真核和原核表达质粒,利用原核表达重组蛋白进行免疫并最终研制出特异性针对p30蛋白的单克隆抗体,为ASF的快速诊断方法和免疫预防等研究提供基础生物材料。主要研究内容及研究结果包括以下三部分:1.非洲猪瘟病毒p30基因的克隆及表达本研究依照GenBank上已发布的非洲猪瘟病毒p30基因序列设计合成一对特异性扩增引物,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因并将其分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1和原核表达载体pET-32a中,构建成真核重组质粒pcDNA3.1-p30及原核重组质粒p30-his。将测序正确的真核重组质粒pcDNA3.1-p30转染293T细胞,应用间接免疫荧光(IFA)和Western Blot实验进行分析,结果显示真核重组质粒pcDNA3.1-p30可以在293T细胞上获得表达并且与ASFV阳性猪血清反应良好。将测序正确的原核表达质粒p30-his转化BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达,通过SDS-PAGE和Western Blot实验证实该重组蛋白可以获得表达且主要是以包涵体的形式存在,分子量大小约为42 kDa,与预期一致。2.非洲猪瘟病毒p30单克隆抗体的研制本研究以p30原核重组蛋白作为免疫原,免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,每间隔10天免疫一次,免疫三次后应用IFA测定小鼠血清效价,选择效价较高的小鼠进行细胞融合。真核重组质粒pcDNA3.1-p30转染293T细胞后应用IFA对杂交瘤细胞上清进行筛选并对阳性细胞进行亚克隆,最终获得两株能稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为ASFV-p30-2F9和ASFV-p30-3F9。以真核重组质粒pcDNA3.1-p30转染293T细胞裂解蛋白为抗原,应用Western Blot实验进行验证后证明获得的两株单克隆抗体均能与p30原核和真核表达蛋白发生特异性反应。亚类鉴定结果表明两株单克隆抗体均为IgG1亚类/Kappa链。用获得的两株杂交瘤细胞制备小鼠腹水,并对两株单抗腹水进行IFA效价测定,结果表明ASFV-p30-2F9单抗腹水IFA效价为1:6400,ASFV-p30-3F9单抗腹水IFA效价为1:3200。3.非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA的反应条件,确定了最佳抗原包被浓度为0.25 μg/mL、待检血清1:400稀释、封闭液和封闭时间选择5%脱脂乳封闭2h、一抗最佳作用时间为1h、二抗最佳作用时间为1h、最佳显色时间为10 min。运用本检测方法检测PRV、PEDV、CSFV阳性血清,结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。通过对12份ASFV阴性血清检测确定ELISA方法临界值,当OD450nm≤0.284时为阴性,OD450nm≥0.341时为阳性,待检血清OD450nm值在两者之间判为可疑,该ELISA方法批内批间重复性良好,变异系数均小于10%。可用于非洲猪瘟病毒感染的监控。