第一部分 丙泊酚辅助睡眠对睡眠剥夺后大鼠血清睡眠相关炎症因子和认知功能的影响目的:通过建立快动眼睡眠剥夺模型,观察丙泊酚辅助睡眠对睡眠剥夺后大鼠血清睡眠相关炎症因子和认知功能的影响。方法:选择9～12周龄、健康、体重260～320 g雄性Sprague-Dawley大鼠100只,随机分为正常对照组(C组)、睡眠剥夺组(SD组)、睡眠剥夺+脂肪乳剂组(SD-F组)、睡眠剥夺后30mg/kg丙泊酚辅助睡眠组(P30组)和睡眠剥夺后60mg/kg丙泊酚辅助睡眠组(P60组),每组20只。SD组、SD-F组、P30组和P60组大鼠采用改良多平台水相睡眠剥夺模型对大鼠实施睡眠剥夺,连续睡眠剥夺96 h,C组饲养于无水睡眠剥夺装置内96 h;C组和SD组大鼠在睡眠剥夺完成后进行相关检测;SD-F组大鼠在完成睡眠剥夺后给予腹腔内注射10%脂肪乳1 mL,1 h后进行相关检测;P30组和P60组大鼠在睡眠剥夺完成后分别给予腹腔内注射丙泊酚30 mg/kg或60 mg/kg诱导其睡眠,待其自然苏醒后进行相关检测;水迷宫实验检测大鼠学习认知功能,HE染色观察大鼠下丘脑、海马、肾上腺和肝脏细胞形态学特征,透射电镜观察海马神经元形态学特征,ELISA检测血清睡眠相关炎症因子(IL-β、TNF-α)和细胞色素 C(cytochrome C,Cyt-C)的表达。结果:水迷宫行为学检测结果:与C组比较,SD组、SD-F组大鼠逃避潜伏期延长、空间探索次数下降(P<0.05);与SD组比较,SD-F组逃避潜伏期和空间探索次数结果无统计学差异,P30组和P60组大鼠逃避潜伏期降低而空间探索次数增加(P<0.05)。HE检测显示:C组大鼠下丘脑、海马、肾上腺和肝脏结构正常,细胞密集、胞浆饱满、核仁清晰,SD组、SD-F组、P30组和P60组大鼠下丘脑HE染色与C组无明显差异,但肾上腺和肝脏组织均呈现细胞肿胀、细胞间隙增大、排列疏松、色淡且染色不均;SD组和SD-F组海马CA1区椎体细胞层次减少、细胞间隙增宽、存在细胞缺失现象,P30组和P60组海马CA1区锥体细胞排列较SD组和SD-F组为紧密、细胞缺失现象少。透射电镜显示:C组大鼠海马CA1区神经元核膜完整、核形态规则、染色质分布均匀;SD组和SD-F组海马CA1区神经元出现核固缩、核碎裂以及染色质边集等现象,可见凋亡小体;P30组和P60组海马神经元核膜完整、染色质分布尚为均匀,染色质边集不明显,未见凋亡小体。ELISA检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α和Cyt-C的表达结果显示:与C组比较,其余四组大鼠血清中IL-1β和TNF-α的表达均增高(P<0.05);与SD 比较,SD-F组的结果无统计学差异,P30组和P60组大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量增高而Cyt-C的表达下降(P<0.05);与C组比较,SD组和SD-F组大鼠血清中Cyt-C表达均增高(P<0.05),P30组和P60组大鼠血清中Cyt-C的表达均无统计学差异。结论:睡眠剥夺可导致大鼠多脏器细胞形态受影响,丙泊酚诱导睡眠可增高睡眠剥夺后大鼠血清IL-1β和TNF-α的表达水平、降低Cyt-C表达水平,减轻海马CA1区神经元凋亡、改善睡眠剥夺后大鼠的认知功能损伤。第二部分 丙泊酚辅助睡眠对睡眠剥夺后大鼠海马神经元线粒体的影响目的:研究丙泊酚辅助睡眠对睡眠剥夺后大鼠海马神经元线粒体形态和功能的影响,探讨丙泊酚改善睡眠剥夺后大鼠海马认知功能的可能机制。方法:选择9～12周龄、健康、体重260～320 g雄性Sprague-Dawley大鼠87只,分为正常对照组(C组,n=15)、睡眠剥夺组(SD组,n=27)、睡眠剥夺+脂肪乳剂组(SD-F组,n=15)、睡眠剥夺后30 mg/kg丙泊酚辅助睡眠组(P30组,n=15)和睡眠剥夺后60 mg/kg丙泊酚辅助睡眠(P60组,n=15);采用改良多平台水相睡眠剥夺法对大鼠实施睡眠剥夺,连续睡眠剥夺96 h,C组饲养于无水睡眠剥夺装置内饲养96 h。C组和SD组大鼠完成干预后进行相关检测;SD-F组大鼠在完成睡眠剥夺后,给予腹腔内注射10%脂肪乳1 mL,1h后进行相关检测;P30组和P60组大鼠在完成睡眠剥夺后,每只动物给予腹腔内注射丙泊酚30 mg/kg或60 mg/kg诱导其睡眠,待其自然苏醒后进行相关检测。透射电镜观察海马神经元线粒体形态学变化;ELISA检测海马组织内睡眠相关炎症因子(IL-1β和TNF-α)、细胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)和ATP的表达,同时检测SD组睡眠剥夺后第48 h和第72 h大鼠海马IL-1 β、TNF-α和Cyt-c c的表达水平;免疫组化检测海马CA1区神经元cleaved caspase-3蛋白阳性率,蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的相对表达量。结果:透射电镜结果显示:C组线粒体大小均一、外膜光滑、线粒体嵴清晰可见、线粒体内无空泡,SD组和SD-F组线粒体大小不一、线粒体外膜边缘毛糙、内部有大量空泡、线粒体嵴模糊不清,可见自噬征象;P30组和P60组大鼠海马线粒体外膜边缘光滑、线粒体嵴清晰可见、线粒体内空泡少见。ELISA检测结果显示:与C组比较,SD组和SD-F组大鼠海马组织内IL-1β和ATP表达水平降低(P<0.05),TNF-α和Cyt-C表达水平增高(P<0.05);与SD 组比较,SD-F 组 IL-1β、TNF-α、Cyt-C 和 ATP 表达水平无统计学差异,P30组和P60组海马组织内IL-1 β表达水平增高(P<0.05)、TNF-α和Cyt-C表达水平降低(P<0.05),P60组海马组织内ATP表达水平增高(P<0.05)。ELISA检测不同睡眠剥夺时点大鼠海马炎症因子和Cyt-C表达:与C组比较,睡眠剥夺后48 h、72 h和96 h后大鼠海马组织内IL-1β表达水平均降低(P<0.05)、TNF-α表达水平增高(P<0.05),而睡眠剥夺72 h和96 h后大鼠海马组织内Cyt-C表达水平增高(P<0.05);与睡眠剥夺48 h组比较,睡眠剥夺96 h后大鼠海马组织内IL-1β含量降低(P<0.05)、TNF-α表达水平增高(P<0.05),睡眠剥夺72 h和96 h后大鼠海马组织内Cyt-C表达水平增高(P<0.05)。免疫组化检测结果:与C组比较,其余各组海马CA1区神经元细胞cleaved caspase-3阳性率增加(P<0.05);与SD组比较,SD-F组海马CA1区神经元细胞cleaved caspase-3阳性率无统计学差异,P30组和P60组海马CA1区神经元细胞cleaved caspase-3阳性率下降(P<0.05)。蛋白免疫印迹法检测结果:与C组比较,SD 组和 SD-F 组 Bcl-2 蛋白表达量降低(P<0.05)、Bax 和 cleaved caspase-3蛋白表达量增高(P<0.05),P30组和P60组Bcl-2和Bax蛋白表达无统计学差异;与SD组比较,P30组和P60组Bax和cleaved caspase-3蛋白表达量下降(P<0.05)。结论:丙泊酚辅助睡眠后可逆转睡眠剥夺导致的大鼠海马组织内IL-1β表达水平的下降以及TNF-α、细胞色素C、Bax和cleaved caspase-3表达水平的升高;丙泊酚诱导睡眠可减轻睡眠剥夺诱发的大鼠海马神经元线粒体损伤和凋亡。第三部分 PINK1/Parkin自噬信号通路在丙泊酚辅助睡眠减轻睡眠剥后大鼠海马神经元线粒体损伤中的作用目的:探讨PINK1/Parkin自噬信号通路在丙泊酚诱导睡眠减轻睡眠剥夺后大鼠海马神经元线粒体损伤中的作用。方法:选择9～12周龄、健康、体重260～320 g雄性Sprague-Dawley大鼠181只,采用改良多平台水相睡眠剥夺法建立大鼠的REM睡眠剥夺模型,连续睡眠剥夺96小时。首先探讨不同剂量丙泊酚对海马组织内自噬蛋白Beclin1相对表达的影响,大鼠分为:正常对照组(C组)、睡眠剥夺组(SD组)、睡眠剥夺+丙泊酚5 mg/kg组(P5组)、睡眠剥夺+丙泊酚10 mg/kg组(P10组)、睡眠剥夺+丙泊酚15 mg/kg组(P15组)、睡眠剥夺+丙泊酚30 mg/kg组(P30组)、睡眠剥夺+丙泊酚45 mg/kg组(P45组)和睡眠剥夺+丙泊酚60mg/kg组(P60组),每组3只,蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白Beclin1的相对表达量。其次探讨自噬在睡眠剥夺后大鼠海马认知功能损伤的作用,大鼠分为:正常对照组(C组)、睡眠剥夺组(SD组)、睡眠剥夺+脂肪乳剂组(SD-F组)、睡眠剥夺+丙泊酚30 mg/kg组(P组)、睡眠剥夺+雷帕霉素0.5 mg/kg组(R组)、睡眠剥夺+雷帕霉素0.5 mg/kg+丙泊酚30 mg/kg组(PPR组)、睡眠剥夺+3-MA0.5 mg/kg组(3-MA组)和睡眠剥夺+3-MA 0.5 mg/kg+丙泊酚30mg/kg组(PM组),每组14只,水迷宫行为学检测大鼠认知功能改变,透射电镜观察海马神经元形态学改变,蛋白免疫印迹法检测海马组织自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相对表达。最后探讨PINK1/Parkin自噬信号通路在丙泊酚减轻大鼠睡眠剥夺后海马线粒体损伤中的作用,大鼠分为:正常对照组(C组)、睡眠剥夺组(SD组)、睡眠剥夺+脂肪乳剂组(SD-F组)、睡眠剥夺后30 mg/kg丙泊酚辅助睡眠组(P30组)和睡眠剥夺后60mg/kg丙泊酚辅助睡眠(P60组),每组9只;qRT-PCR检测海马组织自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3基因的mRNA相对表达水平,免疫组化观察海马CA1区神经元PINK1、Parkin和LC3蛋白阳性率,Western blot检测海马组织自噬相关蛋白PINK1、Parkin、p62、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相对表达量。结果:1.不同剂量丙泊酚对海马组织自噬蛋白Beclin1蛋白相对表达量的影响结果:与C组比较,SD组、P5组、P10组和P15组Beclin1蛋白相对表达量增高(P<0.05);与SD组比较,P30组、P45组和P60组Beclin1蛋白相对表达量均降低(P<0.05);分别与P5组、P10组和P15组比较,P30组、P45组和P60组Beclin1蛋白相对表达量均为降低(P<0.05)。2.自噬在睡眠剥夺后大鼠海马认知功能损伤的作用:水迷宫行为学第5日测试结果:与C组比较,SD组、SD-F组、PR组和R组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.05),P组、PM组和3-MA组大鼠逃避潜伏期无统计学差异;与R组比较,P组、PM组和3-MA组大鼠逃避潜伏期均降低(P<0.05)。空间探索实验结果:与C组相比,SD组、SD-F组、PR组、R组大鼠穿越平台次数下降(P<0.05);与SD组比较,P组、PM组和3-MA组大鼠空间探索次数上升(P<0.05)。透射电镜观察海马神经元显示:SD组、SD-F组、R组和PR组线粒体被膜结构包绕形成吞噬泡,部分呈现典型的花生状,线粒体内线粒体嵴形态模糊;C组、P组、3MA组和PM组电镜图显示神经元线粒体被膜结构包绕少见;Western blot自噬相关蛋白检测显示:与C组比较,SD组、SD-F组和R组LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量增高(P<0.05);分别与SD组、SD-F组、R组和PR组比较,P组、PM组和3-MA组Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量均降低(P<0.05)。3.探讨PINK1/Parkin自噬信号通路在丙泊酚减轻睡眠剥夺后大鼠海马神经元损伤中作用:qRT-PCR检测自噬相关蛋白基因mRNA的相对表达水平结果:与C组相比较,海马组织中自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3基因mRNA相对表达水平在SD组和SD-F组增高(P<0.05),在P30组和P60组降低(P<0.05);与SD组比较,P30组和P60组海马组织中自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3基因mRNA的表达水平下降(P<0.05)。免疫组化检测各组大鼠海马CA1区神经元PINK1、Parkin、LC3蛋白阳性率:与C组比较,SD组、SD-F组和P30组海马CA1区神经元PINK1、Parkin、LC3蛋白阳性率增加(P<0.05);与SD组比较,SD-F组组海马CA1区神经元PINK1、Parkin、LC3蛋白阳性率无统计学差异,P30组和P60组海马CA1 区神经元 PINK1、Parkin、LC3 蛋白阳性率降低(P<0.05)。Western blot检测PINK1、Parkin、Beclin1、P62和LC3蛋白相对表达量结果:与C组比较,SD组和SD-F组PINK1、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量增高(P<0.05),SD组Parkin蛋白和p62蛋白相对表达量升高(P<0.05);与SD组比较,P30组和P60组PINK1、Beclin1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量降低(P<0.05)。结论:睡眠剥夺可能通过增强大鼠海马线粒体自噬,导致认知功能损伤;丙泊酚辅助睡眠可减轻大鼠海马线粒体自噬,改善睡眠剥夺诱发的大鼠认知功能损伤,这可能丙泊酚与抑制PINK1/Parkin线粒体自噬信号通路有关。