DNA条形码(DNA barcoding)是一种通过较短的DNA序列片段来鉴定物种的方法。由于快速准确的特点,使采用DNA条形码对生物物种进行鉴定分类的方法越来越为大家所采用,并已经应用到多个研究领域内,例如:物种鉴定,隐蔽物种的发掘,追踪入侵物种,物种保护,以及群落生态学的研究等。当前DNA条形码方法通常是基于单一的线粒体基因,例如细胞色素氧化酶I(COI)。细胞色素氧化酶I因为具有突变率高且在大多数动物群体中容易通过通用引物扩增获得,所以自从十几年前被提出以后,就成为动物DNA条形码的通用标记。不过如果这种条形码方法应用到物种分化时间不长的物种上或者存在基因交流的相近物种上往往不能得到理想的效果。随着分子生物学的发展,越来越多的研究者认为使用单个COI序列对生物体进行物种鉴定是不准确的。两个物种拥有一个相同的位点是可能的,例如两个物种可能共享相同的COI序列,但是两个物种拥有多数相同的独立位点是不可能的。Dowton等人于2014年提出一个“第二代条形码”的新概念,指出只用一个基因位点作为条形码进行物种鉴定有一定的缺陷性,并用两个基因位点作为DNA条形码验证了这一理论框架。第二代条形码技术采用COI和CAD这两个基因位点进行分析,采用BEAST与BPP相结合的方法进行数据分析,从而进一步提高物种鉴定的准确性。不过Dowton等人的研究因为位点数目太少,选用的物种数据也不具有挑战性,无法证明第二代条形码比传统DNA条形码的优越性。多个位点作为条形码对生物个体进行物种鉴定已受到部分研究者的认同。这里我们基于“第二代条形码”提出一个更为有效的多位点DNA条形码的研究框架---基于靶基因富集和二代测序的物种鉴定。本研究中,我们通过使用实际数据以及模拟数据进行两方面验证,结果均显示:随着使用的独立位点个数的增加,其物种鉴定的准确率升高。在足够的长的分化时间或在此基础上存在一定的基因交流的情况下,单个位点的DNA条形码鉴定出现错误的时候,是可以用多个独立的位点进行准确的物种鉴定的。同时也根据模拟数据分析得到对物种鉴定准确率的提高不在于单个位点的长度,而在于位点的个数。根据实验数据以及模拟数据的分析,我们最终确定使用500个独立位点作为标记进行物种鉴定,此500个标记是在辐鳍鱼类范围内众多鱼类均能富集得到的且变异性较大的。在此基础上,我们开发了一套包含三步流程的物种鉴定方法,以此来进行准确的物种鉴定。第一步计算遗传距离,第二步建立物种树,第三步进行BFD*贝叶氏物种界定。经实验数据及模拟数据的多次验证,我们的方法都能够对个体进行准确的物种鉴定。我们预期随着高通量测序成本的进一步降低,多位点DNA条形码可以作为目前单个位点的DNA条形码的补充,来更准确地进行物种鉴定,帮助我们更好地研究生物多样性。