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葡萄(Vitis vinifera)属于葡萄科葡萄属。作为我国重要的落叶果树之一,在我国大部分地区都有种植。我国葡萄以鲜食为主,占葡萄总产量的80%以上。随着人们消费需求的提高,生产者和研究者在保证果品产量增加的同时,转向开发新、奇、特的高品质产品。果实形状是果实外观品质的重要组成部分,多为数量性状,由多基因控制。采用传统的育种方式进行果形改良,需要相当大的种植规模以及相当长的筛选时间。从基因和发育遗传学层次研究和明确果形的遗传规律,实现对果形遗传的整体控制,将是园艺作物果形研究的重要方向。 本研究分别从葡萄品种‘美人指’和‘红宝石无核’中克隆得到可能与果形相关的基因VvGW2和VvOVATE。对基因进行生物信息学分析,亚细胞定位研究及实时荧光定量PCR分析。VvOVATE转化番茄对该基因的功能进行初步验证。主要研究结果如下: 1.在NCBI中查找与水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列,通过RT-PCR和RACE技术进行基因克隆,生物信息学进行结构分析,实时荧光定量PCR分析VvG W2基因在‘美人指’不同时期和不同葡萄品种开花期的表达情况。从‘美人指’葡萄中克隆得到一个GW2基因同源序列,命名为VvGW2。该基因开放阅读框长度为1272bp,共编码423个氨基酸,具有GW2蛋白保守的RING型结构域,该RING型蛋白为C5HC2类型。推测编码蛋白相对分子质量为46.96KD,理论等电点为4.68。与GenBank中登录的其他植物GW2蛋白序列相似性为47%-53%。亚细胞定位结果显示,VvGW2基因编码的蛋白定位于细胞质中。实时荧光定量RT-PCR分析结果表明,VvGW2基因在‘美人指’葡萄的各时期均有表达,开花期基因表达量最高。不同品种中,VvGW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种‘美人指’的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低。推测VvGW2基因在不同时期和不同品种中的表达量上的差异可能与葡萄果实形状相关。 2.在NCBI中查找与番茄果形基因OVATE同源性最高的葡萄序列,通过RT-PCR和RACE技术,从‘红宝石无核’葡萄中克隆得到一个OVATE基因序列。该基因开放阅读框长度为1083bp,共编码360个氨基酸,具有OVATE蛋白保守的OVATE域。与GenBank中登录的其他植物OVATE蛋白序列相似性为40%-70%。亚细胞定位结果显示,VvOVATE基因编码的蛋白定位于细胞核上。实时荧光定量RT-PCR分析结果表明,VvOVATE基因在‘红宝石无核’和‘美人指’各时期均有表达,‘红宝石无核’葡萄品种在开花后30天表达量最高,而‘美人指’葡萄品种在开花期表达量最高。推测在两个葡萄品种中,VvOVATE基因表达量和表达时间的差异可能影响葡萄果实的形状。 3.成功构建了植物表达载体PBI121-VvOVATE,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化番茄子叶。利用GUS组织化学染色得到了9个株系的阳性植株,提取GUS染色阳性番茄植株的DNA进行PCR检测,7个株系可以检测到目的基因片段,说明VvOVATE基因已经整合到7个检测株系的基因组中。对PCR阳性的株系进行RT-PCR扩增,3个株系扩增出目的基因,表明VOVATE在转基因株系中能够顺利转录,最后获得3个株系的转基因植株。对转基因株系进行表达分析,结果发现,VvOVATE基因在转基因番茄开花期至果实着色期表达量较高,在幼果期表达量达到最高,而在开花前和果实着色后表达量低。表型观察发现,转基因番茄营养器官和花器官均发生变化。表现为:植株矮小,叶片变小且圆,花和果实均变小。这些结果表明,VvOVATE基因可能抑制植物的生长发育。