抗隐孢子虫卵黄抗体(Immunoglobulin of Yolk,IgY)的研究

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kldzn2004
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本研究以饱和蔗糖溶液漂浮法收集到河南固始鸡源隐孢子虫分离株,经鹌鹑传代纯化后,得到纯种卵囊,卵囊呈长卵圆形,测卵囊平均大小为6.5υm×4.7μm,卵囊形状指数1.31;在动物感染实验中,正常和免疫抑制情况下均不能感染小白鼠,但能成功感染雏鸡,出现明显的呼吸道症状及法氏囊病变,主要寄生在法氏囊、气管和泄殖腔等部位。根据卵囊形态学及寄生部位等特点,初步鉴定本实验分离虫种类为禽贝氏隐孢子虫(C.baileyi)。并研究了感染剂量和免疫抑制剂对雏鸡的排卵囊规律的影响,结果表明适量增大感染剂量,可使排卵囊高峰期提前并延长,排卵囊强度增大,持续期也延长;使用免疫抑制剂可使高峰期提前,延长高峰持续期,排卵囊强度增大,但免疫抑制剂会造成试验动物死亡率增高,饮食明显减少,排粪量下降,收集的卵囊量相应减少,不利于扩增隐孢子虫卵囊,且增加生产成本。 利用上述经实验室扩增后的鸡源隐孢子虫卵囊,以改进的Sheather蔗糖梯度离心法提纯卵囊,低速离心结合滤膜微滤除菌后,通过反复冻融和超卢波处理的全卵囊抗原,以福氏完全和非完全佐剂制备免疫抗原,设定四种免疫程序,免疫开产健康母鸡,选择最适免疫程序,结果显示首免、二免剂量均为5×10~7个/只,免疫间隔6周,免疫次数2次的第一组,每次免疫剂量均为1×10~7个/只,免疫间隔15~20天,免疫次数4次的第三组不能取得好的免疫效果,应用免疫抗原量梯度增加的免疫方法的第二组,取得了满意的抗体水平,一免、二免抗原量分别为1×10~7个/只,2×10~7个/R,三免、四免抗原量均为3×10~7个/只,五免、六免抗原量均为5×10~7个/只,每次免疫间隔15~20d,共免6次。第二组母鸡免疫后卵黄抗体逐渐上升,四免后15d升幅更为显著(ELISA效价1:20000),在六免后15d,卵黄抗体水平达到1:144000,峰值区域(1:384000~1:512000)持续8周左右,6免后135d,卵黄抗体水平仍维持在1:144000;卵黄抗体的消长趋势与血清抗体的基本一致,但卵黄抗体水平明显高于同期血清抗体水平。采用间接ELISA法和免疫荧光法对获得的卵黄抗体进行鉴定,获得IgY具有隐孢子虫属特异性。荧光法进行抗原位点定位,发现IgY抗体对卵囊的锐顶部和子孢子的识别明显强于卵囊的其他部位,这些位点存有更多的保护性抗原。以水稀释-盐析法纯化本次实验获得的IgY抗体,经SDS-PAGE分析后,提纯后的IgY抗体,主要有2条蛋白条带,即62KDa~68KDa左右的重链,33KDa左右的轻链。IgY抗体在65℃以下对活性无影响,70℃ 15min后活性下降20%左右,75℃ 15min,活性下降了80%左右,80℃ 15min活性基本无活性。IgY在PH4~10时活性无明显变化,PH<2或>11时活性明显下降,具有良好的耐酸碱性。 应用体外动物感染治疗试验研究了抗隐孢子虫特异性卵黄抗体的治疗效果。结果表明:
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