研究背景和目的:　　中药是中华民族的传统药（Traditional Chinese Medicine，TCM）。中药的发明与应用不仅有着较为悠久的历史，而且具有独特的应用形式和理论体系。科研工作者们用现代科学方法对中药做了大量研究工作，发现许多中药活性成分具有抗菌、抗病毒、抗癌药、防治心血管疾病等功效。癌症的治疗是医学的难题，临床中主要采用手术、放化疗及等方法治疗癌症，成功率并不高，副作用明显。近年来，中药及其活性成分治疗肿瘤已成为研究热点。中药可以提高癌症患者的免疫力，同时也有抑制癌细胞增殖及杀死癌细胞的作用，具有副作用小、疗效好、低毒性、药源广等优势。　　但是，目前许多中药及其活性成分抗肿瘤机制尚不完全清楚，其相关研究正日益受到重视。研究表明，miRNA的异常表达参与了癌症的发生、发展。miRNA已被作为新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断中。因此，研究中药活性成分如何调控与癌症相关miRNA显得意义重大。当前主要是采用实时荧光定量PCR的方法来监测中药活性成分对癌症相关miRNA的表达量变化。这种检测方法灵敏度和特异性均较高，但实验所需要的PCR设备和配套的材料试剂成本较高，而且操作步骤繁琐耗时。同时，由于在PCR反应时需加入荧光基团，增加了实验室污染的概率。所以，发展新的检测方法实现高灵敏、快速、低成本的检测尤为重要。　　当前仿生纳米通道的快速发展，为生物分子检测提供了一个新的分析平台。仿生纳米通道的诞生来源于生物学离子通道。由于它独特的三维纳米结构，因此通道具有高比表面积，有利于通道表面进行高效率的功能化修饰；同时又由于纳米限域效应，在狭小的纳米空间内，提高了检测底物与配体相互作用的几率，并可以根据需要来控制通道的内径大小以及修饰的功能团，使其对检测底物具有高的特异性、灵敏度和快速性。因此近年来仿生纳米通道在生物分子的分析检测领域备受关注。　　本研究首先构建一种基于仿生纳米通道的生物传感器，用于DNA和miRNA高灵敏和高特异的检测。同时，利用该传感器还可以实施肿瘤细胞中miRNA的检测。在此基础之上，运用该传感器监测中药活性成分调控与肿瘤相关的miRNA，这一方法的建立为探讨中药治疗癌症的机理提供理论和技术支持。　　方法与结果:　　本课题的主要内容包括以下四个部分：　　第一部分：层层自组装构建仿生纳米通道DNA生物传感器　　选用聚合物薄膜Polyethylene terephthalate（PET）作为构建纳米通道传感器的基材。采用潜径迹-不对称化学蚀刻的方法制备锥形多孔纳米通道。通过 FE-SEM表征锥形通道的大口端和小口端直径。蚀刻后，纳米通道表面带有大量羧基，带负电荷。将带有大量正电荷的聚合物PEI通过静电作用自组装在通道表面后，再将负电荷的探针DNA组装在纳米通道表面的内壁上，并用 BSA封闭活性位点减少非特异性吸附。通过检测修饰过程每一步I-V曲线整流的变化和XPS的表征证明修饰成功。　　由于 DNA-DNA杂交后，通道表面负电荷增多，因此通过监测杂交前后的离子电流的整流变化可实现目标DNA的检测。该传感器可以在非互补DNA（nc-DNA），双碱基错配DNA（2bm-DNA）和单碱基错配DNA（1bm-DNA）中高特异性地区分出互补 DNA(c-DNA)。由于纳米通道的三维（3D）纳米级环境，这种特殊的几何形状极大地增加了纳米通道的表面积，从而使探针分子固定在内表面上，并扩大了探针与目标分子之间的接触面积。因此，该传感器对目标DNA的检出限可低至10 fM。　　此外，为了进一步研究该纳米通道生物传感器的实际应用，运用该传感器血清样本中的进行DNA检测，实验结果表明，在干扰物浓度高于目标物浓度的100倍的情况下，该传感器也能够检测到目标DNA。在含有1 pM和1 nM c-DNA的5％胎牛血清样品中，该传感器仍然对目标DNA保持高检测能力。　　第二部分：PMO功能化修饰的纳米通道生物传感器超灵敏检测miRNA　　吗啉反义寡核苷酸，PMO(phosphorodiamidate morpholino oligomers)，是一种DNA的类似物，它是将核苷酸碱基替换为吗啉环，将带负电的磷酸基团替换为磷二酰胺，所以PMO不带电荷。将电中性的PMO作为捕获探针通过EDC/NHS共价固定在锥形纳米通道表面，通过与miRNA特异性的杂交可构建基于聚合物仿生纳米通道的高灵敏 miRNA生物传感器。通过检测修饰过程每一步I-V曲线电流的变化和修饰后XPS的表征N1s峰和P2p峰的出现，进一步表明了探针PMO固定在纳米通道表面上。　　由于PMO的电中性特征和高序列特异性亲和力，PMO和miRNA之间的杂交效率得到提高，从而大大降低了背景信号，提高了检测特异性和灵敏度。当目标miRNA和膜表面的PMO杂交时，表面电荷密度明显增加，进而引起过膜电流的变化。而与完全不互补和错配序列作用时电流信号变化很小。通过-2V电压下的电流变化率做柱形图，可以看出该传感器可以从非互补的miRNA（miR-21）和单碱基错配的miRNA（Let-7c）中区分互补的miRNA（Let-7b），表现出较高的特异性。随着Let-7b浓度从100 aM增加到1 nM，-2 V电压下的电流逐渐增大。这说明，在一定浓度范围内，功能化的纳米通道对let-7b具有较好的响应。实验结果表明， PMO修饰的纳米通道生物传感器可实现1 fM miRNA的检测。通过平行4组实验，发现-2V处电流变化率相当，表明该传感器具有良好的可重现性。杂交后的纳米通道可通过加入无水乙醇去杂交，随后将 Let-7b加入纳米通道进行再杂交。通过重复该过程，连续进行变性和再杂交，发现该传感器能重复使用。同时，该传感器还可以实现检测血清样品中的目标miRNA，检测限可低至10 fM。　　第三部分：基于DSN信号放大策略的纳米通道miRNA生物传感器　　采用无机材料，多孔阳极氧化铝膜（PAAOM）作为基材，该通道是圆柱形对称结构，通过FE-SEM表征锥通道的直径约为55 nm。通道表面化学修饰后将氨基修饰的DNA探针固定在纳米通道的内表面，通过检测修饰过程每一步I-V曲线电流的变化和XPS的表征，进一步表明了探针DNA已成功固定在纳米通道表面上。　　双特异性核酸酶（DSN）能够选择性降解双链 DNA和 DNA-RNA杂交体中的 DNA,但对单链核酸分子几乎没有作用。DNA修饰的纳米通道与目标miRNA杂交形成双链后，DSN会剪切该双链中的DNA链，释放出的目标miRNA又继续和其他的DNA探针杂交，可不断重复剪切、释放、和杂交的过程，在整个过程中DSN与miRNA可重复使用，通过DSN的放大机制可实现 miRNA高灵敏的检测。当目标 miRNA与探针DNA杂交时，由于DSN剪切杂交后的DNA探针并释放出miRNA。因此，纳米通道表面的电荷明显减少，可以通过监测杂交前后的过膜电流的变化进而实现对目标miRNA的检测。利用LSCM可表征纳米通道表面DNA探针和目标miRNA杂交以及DSN剪切的过程。用相同电压下的电流变化率做柱形图发现 miR-21的相对离子电流变化率远大于 nc-miRNA和1bm-miRNA的相对离子电流变化率。这说明，DNA修饰的PAAOM纳米通道生物传感器可以区分1bm-miRNA和 nc-miRNA和 miR-21，表明该传感器的特异性较高。由于DSN引入了DSN的放大策略，该传感器具有较高的灵敏度，可实现低至1 fM miRNA的检测。同时，该生物传感器还被成功地用于乳腺癌细胞 MCF-7中 miRNA的检测，为监测中药活性成分调控与肿瘤细胞中相关miRNA的提供了一种新的检测方法。　　第四部分：纳米通道传感器监测中药活性成分调控肿瘤细胞中相关miRNA的研究　　在第3章的工作基础上，选取四种中药活性成分，分别为姜黄素、白藜芦醇、羟基喜树碱、丹参酮Ⅰ与乳腺癌 MCF-7细胞株相互作用，采用基于DSN信号放大策略的纳米通道生物传感器，高灵敏的监测肿瘤细胞与中药抗癌活性成分作用前后miR-21的变化。　　将中药活性成分白藜芦醇、丹参酮Ⅰ、羟基喜树碱、姜黄素分别与MCF-7细胞共孵育后，使用试剂盒分别提取 miRNA，加入 DSN后分别将4种混合液与DNA修饰的PAAOM传感器相互作用后检测电流变化。结果表明，未与中药相互作用的MCF-7中miR-21表达丰富，可检测到明显的电流信号变化。在相同的实验条件下，加药的四组会发现，电流信号变化较小。其中，羟基喜树碱组和姜黄素组电流变化最小。这说明，四种药物与MCF-7细胞株相互作用后，中药活性成分抑制了MCF-7中miR-21的表达，因而使纳米通道传感器的电流变化较小。同时，这一系列结果也通过RT-qPCR得到了进一步的佐证。　　与此同时，采用 MTT法和流式细胞技术分别测定了四种中药活性成分对乳腺癌 MCF-7细胞株存活率和凋亡率的影响。结果表明，姜黄素、白藜芦醇、喜树碱、丹参酮Ⅰ对乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用，并且随着药物浓度的增大，孵育时间延长，细胞抑制率越高，其抗癌作用也越强。细胞的凋亡率与药物的浓度成依赖关系，随着药物浓度的提高，细胞的凋亡率显著增强。这说明，这四种药物在一定的浓度范围内会促进 MCF-7细胞的凋亡。以上结果均表明这四种中药活性成分对癌细胞有明显的抑制作用，中药作用后与癌症相关miR-21的表达量相对降低，细胞株存活率降低、凋亡率升高。这部分的工作为进一步探索中药抗癌活性成分对于癌症的作用及其相关机制奠定了基础。　　结论:　　1、构建了层层自组装的仿生纳米通道生物传感器，用于高灵敏和高特异的DNA检测。　　2、构建了PMO功能化的纳米通道生物传感器，用于miRNA的超灵敏检测。　　3、构建了基于DSN信号放大策略的纳米通道生物传感器，实施了癌症细胞提取miRNA的检测。　　4、采用纳米通道传感器监测中药活性成分调控肿瘤细胞中相关miRNA，为阐明中药治疗癌症提供新思路。