前言：　　 心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemia-reperfusioninjury,MIRI)是指心肌缺血后一定时间内恢复血供,不仅未能完全改善心脏功能,反而加重原有的缺血性心肌损伤,出现心律失常、心肌梗死面积增大、心脏衰竭等更严重的损伤。随着心脏移植、冠状动脉搭桥以及经皮冠脉介入等治疗手段广泛地应用于临床,心肌缺血再灌注损伤已成为临床上常见的一种病理生理现象。心肌缺血及缺血再灌注中均伴有心肌细胞的凋亡,从而对心脏的结构和功能产生重要的影响。因此,探索有效的药物防治心肌缺血再灌注损伤、抑制心肌细胞凋亡,改善心脏功能有重要的临床意义。　　 胡黄连苷Ⅱ(picrosideⅡ)从玄参科植物西藏胡黄连的根茎提取的环烯醚萜苷类化合物。在神经细胞及其他细胞系的研究中发现它具有抗凋亡的作用。体外实验发现胡黄连苷Ⅱ能抑制H2O2诱导PCI2细胞损伤及凋亡,激活细胞内信号转导通路促进生长。胡黄连苷Ⅱ对心血管氧化应激的作用还未有报道,但有研究表明胡黄连苷Ⅱ能抑制脑缺血再灌注动物模型中的氧化应激,在外周组织如肾脏中,胡黄连苷Ⅱ也具有保护作用。因此,我们很有理由去研究胡黄连苷Ⅱ是否也能对抗心血管疾病中的氧化应激损伤。　　 PI3K-Akt信号通路是重要的促细胞存活信号转导通路,该通路能够抑制多种刺激所致的细胞凋亡,维持细胞存活。多种生长因子均可通过PI3K途径激活Akt/PKB。完全活化的Akt通过磷酸化和钝化其下游底物,经由多种途径而促进细胞的存活。Akt介导的Bcl-2上调对于心肌细胞的存活也具有重要作用。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)是Akt的下游信号分子,CREB被Akt磷酸化后成为活性CREB(即p-CREB),p-CREB又可促进下游分子Bcl-2的转录,进而调节细胞的存活。根据功能可将Bcl-2基因家族分为两类:一类是抗凋亡的,如Bcl-2、Bcl-XL;一类是促凋亡的,如Bax、Bad等。越来越多的研究发现,位于线粒体外膜的Bcl-2家族蛋白,能通过改变线粒体细胞膜的通透性,诱导细胞凋亡。　　 为此本实验拟采用SD乳鼠原代培养的心肌细胞,建立H/R模型。观察了在离体细胞给予胡黄连苷Ⅱ治疗是否可以减轻缺氧/复氧损伤导致心肌细胞凋亡以及分析了胡黄连苷Ⅱ抗心肌细胞凋亡的信号转导机制,尤其是胡黄连苷Ⅱ的这种保护作用是否是部分通过激活传导通路PI3K/Akt-CREB,调节Bcl-2和Bax的表达而实现的。　　 材料与方法：　　 1.以原代培养的SD(Spmgue-Dawley)乳鼠心肌细胞作为研究对象,并通过缺氧3h复氧2h建立缺氧/复氧模型。设立正常对照组、缺氧/复氧组(H/R)、胡黄连苷Ⅱ(50、100、200μg/ml)预处理组(H/R+50、100、200μg/mlpicrosideⅡ)、wortmannin+胡黄连苷Ⅱ预处理组(H/R+pierosideⅡ+wortmannin组)及LY294002+胡黄连苷Ⅱ预处理组(H/R+picrosideⅡ+LY294002组)。浓度根据已有文献和预实验确定。　　 2.原代培养乳鼠心肌细胞,胡黄连苷Ⅱ和/或H/R共同处理,收集细胞及细胞培养液:分别加入PI3K的特异性抑制剂wortmannin及LY294002进行干预,收集细胞及细胞培养液,用于指标检测。　　 3.采用四唑盐(MTT)法检测胡黄连苷Ⅱ对原代培养乳鼠心肌细胞存活率的影响。　　 4.应用乳酸脱氢酶(LDH),超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞LDH,SOD,MDA的活性。　　 5.采用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的浓度。　　 6.应用及AnnexinV-FITC/PI和hoechst33258试剂盒检测细胞的凋亡。　　 7.采用底物酶解荧光法检测caspase-3活性,反映心肌细胞的凋亡程度。　　 8.采用westernblotting法检测原代培养乳鼠心肌细胞Akt、p-Akt、CREB、p-CREB、Bcl-2和Bax蛋白的表达。　　 9.各实验组数据均用-x±s表示,利用spss11.5统计软件分析,组间差异比较采用单因素方差分析。P＜0.05为有统计学差异。　　 结果：　　 1.培养3天的心肌细胞在实施缺氧期3h后,LDH和MDA均较缺氧前有所升高,SOD降低(P＜0.01);而给予复氧期2h后,LDH和MDA明显高于缺氧期,而SOD进一步降低(P＜0.01),对照组的上述指标在相应时间点未见明显改变(P＞0.05)。　　 2.200μg/mlpicrosideⅡ处理0h、24h、48h、72h,较对照组细胞存活率明显升高。PicrosideⅡ作用48h时,心肌细胞存活率达峰值(92.3±3.02%)。　　 3.不同浓度50、100、200μg/mlpicrosideⅡ预处理可以减轻H/R诱导的细胞损伤,随着picrosideⅡ浓度的增加,相应的MTT检测的OD值也随之增加分别为74.17±3.51,83±4.5%and92.02±3.6%。　　 4.H/R组在H/R处理后心肌细胞受到损伤,LDH较C组明显增高,损伤后MDA亦较C组明显增高,SOD较C组明显降低(均P＜0.05)。PicrosideⅡ(50,100,and200μg/m1)预处理H/R损伤细胞,均较H/R组细胞损伤小,LDH和MDA含量明显减少,而SOD则较H/R组明显增加。　　 5.经H/R处理后,细胞内荧光强度明显增强,用不同的浓度picrosidcⅡ(50,100,or200μg/mL)预处理48h后,与H/R组相比细胞内荧光强度明显下降为,呈浓度依赖性(140.21±9.11,120.03±8.05and98.12±7.31,respectively)(allPallP＜0.01vsH/R)。##6.AnnexinV-FITC/PI检测心肌细胞凋亡率显示C组细胞的存活率为3.3±0.95%:而H/R组细胞的凋亡率显著升高,凋亡率为27.09±3.42%,说明H/R诱导了心肌细胞的凋亡。用不同浓度的picrosideⅡ(200μg/mL)预处理细胞后再施以H/R,细胞的凋亡率降低至9.05±2.0%(P＜0.01).然而,wortmannin或LY294002预处理能够阻断picrosideⅡ保护作用(23.01±2.80%and21.02±3.10,respectively)(allPallP＜0.01)。　　 7.正常的心肌细胞核呈圆形或椭圆形,染色均匀,呈正常的蓝色,而凋亡细胞的细胞核有明显的染色质边聚呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,变形亮度增强,颜色发白。Hoechst33258结果显示:C组细胞少见白色亮点,picrosideⅡ组细胞见大量凋亡细胞。经picrosideⅡ(200μg/ml)处理后,白色亮点呈明显减少,凋亡细胞明显减低。然而,wortmannin或LY294002预处理能够阻断picrosideⅡ保护作用。　　 8.Westernblotting结果显示:经H/R处理后,Akt、CREB在各组中都有表达,差异无统计学意义(P＞0.05),p-Akt,p-CREB,Bcl-2蛋白表达量较C组明显减少,Bax蛋白表达较C组明显增加,差异具有显著性(P＜0.01)。PicrosideⅡ(50,100,or200μg/mL)可以剂量依赖性地增加p-Akt,p-CREB,Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白的表达,与H/R组比较差均有显著性(P＜0.01)。Wortmannin或LY294002预处理可拮抗picrosideⅡ部分保护作用。　　 结论：　　 1.通过给新生大鼠体外培养心肌细胞行缺氧3h/复氧2h后,可明显造成心肌细胞损伤,以此模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤。　　 2.PicrosideⅡ对心肌细胞存活率的影响具有时间和剂量依赖性。　　 3.PicrosideⅡ通过降低LDH,MDA,增加SOD减轻H/R诱导的细胞损伤。　　 4.PicrosideⅡ可能通过清除细胞内过多的ROS来参与H/R诱导细胞损伤的保护。　　 5.PI3/Akt-CREB途径可能为picrosideⅡ抗H/R诱导细胞凋亡的重要信号转导机制。　　 6.PierosideⅡ还可能通过直接调节凋亡相关Bcl-2、Bax的表达及caspase-3活性而抑制细胞凋亡。