黑果腺肋花楸花色苷对视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

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黑果腺肋花楸,俗称黑果花楸,系蔷薇科属,富含黄酮醇、酚酸、花青素等多种功效成分。其花色苷具有的抗衰老、抗癌、抗疲劳等多种生物功能。近年来,尽管我国在其功能性领域研究有所增加,但在视觉防护领域的研究相对匮乏,随着人口老龄化增长趋势的日益显现,年龄相关性黄斑变性(AMD)患病率逐渐上升,患者对医治的极度渴求,越来越多的专家和学者开始注重这一问题。本论文探讨了超声辅助提取黑果腺肋花楸花色苷的最佳工艺条件,在体外通过建立H2O2诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)氧化应激模型,探讨花色苷对其的保护作用,并且通过建立碘酸钠诱导大鼠视网膜结构病变模型,进一步在体内探讨花色苷对视网膜的保护作用。以下为试验方法和结论。以单因素试验结果分析为基础,以酸化乙醇的体积分数、超声时间、液料比和超声温度这四个为自变量,黑果腺肋花楸花色苷的提取量为因变量,进行响应面试验,最后得出以酸化乙醇体积分数为65%(p H=2)、超声时间为44 min、液料比为18:1(m L/g)和超声温度为38℃为最优制备工艺。并在此条件下进行3次平行验证性试验,黑果腺肋花楸花色苷实际提取量平均值达到4.569 mg/g。在体外,用H2O2对ARPE-19细胞进行处理成功模拟氧化应激损伤,利用流式细胞仪测定细胞中ROS荧光强度、细胞凋亡率和细胞线粒体膜电位;MTT法检测细胞的吸光值;检测细胞色素C以及cleaved-caspase 3的蛋白表达用Western-blot法。分析结果表明,黑果腺肋花楸花色苷对H2O2诱导ARPE-19细胞损伤有抑制作用,细胞存活率由60.80%提高到86.75%。加入黑果腺肋花楸花色苷后可以提高细胞对ROS的清除能力,并且促进细胞线粒体膜电位恢复,抑制了胞质中细胞色素C的释放,从而降低cleaved-caspase 3的蛋白表达。与模型组相比,ARPE-19细胞的凋亡率从36.84%降低至11.84%,差异极显著(p<0.01)。试验结果证明,黑果腺肋花楸花色苷可以减少ARPE-19细胞的凋亡而且抑制H2O2的氧化作用。通过成功建立NaIO3诱导的大鼠视网膜氧化损伤模型,应用HE染色和免疫组化染色观察大鼠视网膜组织结构变化;细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3的表达用IHC法检测、Western-blot检测胞质中细胞色素C的表达水平。分析结果表明,黑果腺肋花楸花色苷可以改善由Na IO3注射入尾椎而引起大鼠视网膜组织的损害,且胞质中细胞色素C和细胞凋亡蛋白cleaved-caspase 3的蛋白表达水平亦相对下降,减轻了视网膜细胞凋亡,其中黑果腺肋花楸花色苷剂量达到500 mg/(kg?d)时,对大鼠视网膜结构损伤恢复效果最佳,基本可恢复到正常状态。结果表明,黑果腺肋花楸花色苷可以阻止大鼠视网膜色素上皮脱离,为今后AMD的预防和治疗开辟了新途径。
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