眼睛是人和动物的视觉器官,其主要包括角膜、晶状体和视网膜等结构,它们的异常发育会导致一系列重大眼睛疾病。白内障是最常见的致盲性疾病之一,其症状表现为眼睛晶状体出现浑浊进而导致视力下降。研究表明,自由基的损伤、晶状体上皮细胞凋亡和晶状体蛋白损伤是导致白内障发生的重要因素。目前治疗白内障最有效的方法是通过超声乳化手术并植入人工晶状体,但术后的并发症较严重。年龄相关性黄斑变性(AMD:Age-related Macular Degeneration)是由多因素诱发的老年性眼睛疾病,其特征是视网膜色素上皮细胞和感光细胞的死亡。根据是否有新生血管出现,它可以分为干性和湿性,虽然利用血管内皮生长因子的抑制剂能用来处理并缓解湿性黄斑变性,但无法治愈,而干性黄斑变性无法治疗。因此,探讨白内障和AMD的发病机理及可能的治疗靶点是关系到人类健康的重大科学问题。利用在小鼠动物模型进行白内障和AMD的研究具有重要科学意义。蛋白质SUMO化(Sumoylation)是指类泛素小分子修饰(small ubiquitin-like modifiers简称SUMOs)与其它蛋白相结合的过程。SUMO化已成为蛋白质翻译后一种重要修饰作用,具有十分重要的生理功能,特别是在基因表达和细胞分化的调控方面。SUMO化是一个可逆的酶级联反应,在E1激活酶(SAE1和UBA2)、E2结合酶(UBC9)和E3连接酶(PIAS1和RanBP2等)的作用下,依赖ATP的供能在SUMO小分子与底物蛋白质之间形成异肽键。在眼睛发育过程中,SUMO化对视网膜和晶状体的发育都有重要的调节作用。本实验室的研究表明,SUMO1介导的PAX6 SUMO化是激活P32 PAX6功能的重要环节,对晶体板和晶体泡的形成有重要作用。同时,我们发现SUM01和SUM02/3可以通过对同一种转录因子SP1的调节作用对晶状体上皮细胞的分化产生截然相反的结果,SUM01具有促进晶体上皮细胞分化的功能,而SUM02/3则能抑制晶体上皮细胞的分化。此外,SUMO化可通过调节p53的转录活性调控视网膜色素上皮细胞的凋亡。然而,参与SUMO化的酶SAE1、UBA2、UBC9、PIAS1和RanBP2在晶状体和视网膜中的表达以及功能则有待进一步研究。因此,本论文的主要目的就是探究上述SUMO化酶在小鼠在主要眼睛组织中的表达模式及它们在白内障及AMD动物模型中的表达水平变化。首先,本研究在小鼠眼睛的角膜、晶状体上皮细胞、晶状体纤维细胞和视网膜中对SUMO化酶SAE1、UBA2、UBC9、PIASI和RanBP2的mRNA和蛋白进行了系统的分析,发现五种主要SUMO化酶中SAE1、PIAS1和RanBP2的mRNA分化表达较为明显。五种酶的蛋白在小鼠眼睛的角膜、晶状体上皮细胞和视网膜中均有表达,而在晶状体纤维细胞中的表达较少,其中E1激活酶SAE1、E2结合酶UBC9和E3连接酶PIAS1在视网膜中的表达较高,而E3连接酶RanBP2在角膜中的表达相对较高。此外,本论文进一步分析了这五种SUMO酶在小鼠晶状体上皮细胞系α TN4-l、人晶状体上皮细胞系HLE、人胚胎晶状体上皮细胞系FHL124、兔晶状体上皮细胞系N/N1003A、人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19这五种常用的细胞系中的表达水平,并通过免疫荧光技术检测了它们的核质定位情况。在此基础上,本论文在小鼠中建立了紫外线和过氧化氢诱导的白内障模型和碘酸钠诱导的AMD模型,并分别分析了晶状体上皮细胞和视网膜中五种SUMO化酶的表达变化。结果表明,在过氧化氢诱导白内障模型中,五种SUMO化酶的mRNA在晶状体上皮细胞中的表达均有降低,其中UBA2的降低最明显,其对应的蛋白水平的表达也有降低。在蛋白水平,RanBP2的降低最明显,PIAS1也降低较多。在紫外线诱导的模型中,UBA2的蛋白降低最明显,在mRNA水平则是RanBP2的降低较明显。在碘酸钠诱导的AMD模型中,SAE1、UBA2、UBC9和PIAS1 mRNA在视网膜色素上皮细胞中的均有减少,而RanBP2 mRNA则明显上调。此外,在蛋白水平,在碘酸钠注射第一天,五种酶在视网膜中的表达有不同程度的降低,在第三天,SAE1、UBA2、UBC9、PIAS1的表达依旧降低,而RanBP2的表达则升高,说明RanBP2在AMD中的作用除了作为SUMO化E3连接酶,可能还有其他功能。最后,根据PIAS1在白内障模型中的差异性表达,我们进一步在小鼠晶状体上皮细胞系α TN4-1中分析PIAS1的功能。利用Crispr-Cas9技术敲除α TN4-1中的PIAS1基因并建立了稳定的细胞系。在过氧化氢诱导细胞凋亡的情况下检测细胞活性,发现PIAS1敲除的α TN4-1细胞的存活率相对较高。另一方面,通过构建PIAS1的pEGFP-C3质粒,同样用过氧化氢处理,细胞凋亡流式分析发现,过表达PIAS1的α TN4-1细胞的凋亡相对增多,与PIAS1敲除对细胞具有保护作用的结果是吻合的。因此PIAS1过氧化氢诱导的α TN4-1细胞凋亡有重要调节作用。这些观察结果与之前在U202细胞、MEF细胞和Hela细胞中的研究结果一致。本论文利用现代分子生物学的方法,首次阐明了五种蛋白质SUMO化酶在主要眼睛组织和常用晶状体上皮细胞和视网膜色素上皮细胞系中的表达模式。在此基础上,进一步分析了重大眼睛疾病白内障和AMD动物模型中,上述五种SUMO化酶的表达水平变化,最后利用Crispr-Cas9介导的敲除技术和荧光载体驱动的过表达方法初步探讨了 PIAS1在晶状体上皮细胞中对细胞活性的调节,这些结果为进一步探讨SUMO化在眼发育和重要眼睛疾病中的功能打下必要的生物学基础。