研究背景胸腔积液(pleural effusion)是胸膜疾病最常见的临床表现之一,根据临床影响因素和患者预后的不同,胸腔积液往往分为两种类别,即良性胸腔积液(benign pleural effusion,BPE)和恶性胸腔积液(malignant pleural effusion,MPE)。由于两种类型胸腔积液的病因和预后存在很大区别,因此对于两者的准确鉴别尤为重要。但是长期以来,良恶性胸腔积液的鉴别诊断一直是困扰临床医生的一大问题。尽管胸腔积液中找到肿瘤细胞的是诊断胸腔积液的“金标准”,但是其阳性率各方报道变异很大,在40%‐87%之间[1]。此外,对于胸水细胞学阴性的胸腔积液,目前使用的一些指标,如乳酸脱氢酶(LDH)、腺苷脱氢酶(ADA)、癌胚抗原(CEA)等,在某种程度上有一定的鉴别价值,但是这些标志物的特异性和敏感性不十分理想。故探讨一种敏感度及特异度高的鉴别良恶性胸腔积液辅助检测方法,为临床诊断提供依据非常必要。近年来,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)检测逐渐进入精准医学时代。目前已有众多研究者在探索CTC的诊断价值、预后价值、疗效监测和预测肿瘤复发等方面作出了很大贡献。作为血液中的“稀有细胞”,CTC的检测在技术层面上的要求通常很高。Cellsearch系统长期以来作为CTC检测的“金标准”;但是在深入研究和临床使用过程中,Cellsearch系统的局限性逐渐显现出来,主要是由于无法检测到发生“上皮—间质转化”(epithelial‐mesenchymal transition,EMT),造成假阴性结果。随着技术的不断革新,免疫磁珠分选法悄然进入科学家的视野。这种细胞富集法与Cellsearch系统不同,它不依赖上皮标志物的表达,可富集到发生EMT的肿瘤细胞。免疫磁珠分选法分为阳性和阴性分选法。由于阳性分选法受到肿瘤细胞异质性的影响,且可能引起肿瘤细胞内部分子信号通路的活化。而阴性分选法通过去除标本中的白细胞和红细胞等成分,使得富集到的CTC处于自然状态,且不依赖肿瘤细胞表面分子的表达,因而阴性分选法适用于任何肿瘤类型的CTC富集,应用更为广泛。通过方法学的改进,目前阴性富集理论上回收率能够达到100%[2]。富集后的细胞成分经过免疫荧光染色后可去除白细胞,采用荧光原位杂交技术进一步鉴定后可用于后续的功能分析。CTC鉴定方法主要有基于肿瘤细胞表面抗原表达、细胞特异性m RNA表达以及染色体核型异常等而进行的实验方法。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)已被证实可用于前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等上皮来源肿瘤的细胞鉴定。FISH不依赖肿瘤细胞表面分子标记物的表达,因而可以检测上皮细胞特异性标记物表达弱化或消失的CTC,同时可以在显微镜下直观的观察到恶性的CTC肿瘤细胞。研究目的探讨免疫磁珠阴性富集法联合FISH技术和免疫荧光染色——SOP‐im FISH技术[3],找到胸水脱落细胞(胸水“CTC”)对诊断恶性胸腔积液的价值。研究方法(一)研究对象:于2015年3月至2017年1月期间在广州市第一人民医院住院的胸腔积液患者,并且符合纳入及排除标准。(二)实验方法:采用免疫磁珠阴性分选法富集胸腔积液和外周血中的CTC,通过FISH杂交信号和免疫荧光染色CD45抗原鉴定所富集的细胞是否为CTCs。同时收集胸水传统细胞学检查结果进行对比分析。(三)实验设计1.样本分组:分为两组,即恶性胸腔积液组(实验组)与良性胸腔积液组(对照组)。1.1恶性胸腔积液病例来源1.1.1纳入标准(1)年龄≧18岁,性别不限(妊娠期、哺乳期女性除外);(2)体格检查和(或)影像学检查证实胸腔积液;(3)经组织病理学或细胞学确诊为恶性肿瘤;(4)能耐受胸腔穿刺抽液;(5)自愿参加本研究者。1.1.2排除标准(1)妊娠期、哺乳期的女性;(2)组织病理学或细胞学未证实为恶性肿瘤;(3)行手术、放化疗后3个月内者;(4)伴有严重心血管、肝、肾等疾病不能耐受胸腔穿刺术;(5)依从性差或拒绝参加此项研究的患者。1.2良性胸腔积液病例来源1.2.1纳入标准(1)年龄≧18岁,性别不限(妊娠期、哺乳期女性除外);(2)表现为渗出液的非恶性胸腔积液,包括结核性胸膜炎、肺炎等其他非恶性疾病所致的胸腔积液;(3)既往无恶性肿瘤疾病病史患者。(4)自愿参加此研究,并能积极配合的患者。1.2.2排除标准(1)妊娠期、哺乳期的女性;(2)因心力衰竭、低蛋白血症、肾病综合征等其他疾病所致的胸腔积液表现为漏出液者;(3)胸腔积液为包裹性或由于量少等其他原因无法行胸腔穿刺引流术者。(4)既往恶性肿瘤病史。2.标本收集:实验组选取2015年3月至2017年1月期间广州市第一人民医院住院患者,经组织病理学或细胞学确诊为恶性胸腔积液共46例,原发病因包括肺腺癌18例、乳腺癌4例、肺鳞癌3例、小细胞肺癌3例、非霍奇金淋巴瘤2例、恶性胸膜间皮瘤1例、鼻咽癌1例、消化道恶性肿瘤7例(食管癌1例、胃癌2例、胰腺癌1例、乙状结肠癌1例、肝癌1例、直肠癌1例)、盆腔恶性肿瘤7例(子宫内膜癌1例、宫颈癌1例、肾癌1例、膀胱癌1例、前列腺癌1例、盆腔囊腺癌1例、卵巢癌1例)。对照组选取同期住院患者,胸腔积液表现为渗出液的肺部良性疾病住院患者27例,包括结核性胸腔积液12例、类肺炎胸腔积液15例。两组均采集血液和胸腔积液。3.统计方法:实验数据均采用SPSS13.0软件包进行统计分析,双侧检验,检验标准设为0.05。计量资料采用均数±标准差(X±S)表示;分类变量:四格表采用Pearson2检验或2检验的连续性校正计算公式。研究结果1.一般资料的比较:本研究共入组患者73例,年龄29~91岁,平均66.9±14.6岁。其中实验组46例,男性28例,女性18例,年龄41~91岁,平均68.17±13.22岁。对照组共27例,男性21例,女性6例,年龄29~90岁,平均64.19±16.71岁。实验组和对照组在性别、年龄、临床表现、胸水性质及影像学检查方面无差异(P均>0.05),两组数据具有可比性。2.实验组共纳入46例标本,其中胸水“CTC”阳性34例,阴性12例;胸水传统细胞学检查阳性21例,阴性25例;外周血CTC阳性20例,阴性26例。对照组共纳入27例标本,其中胸水“CTC”假阳性3例,阴性24例;胸水传统细胞学检查假阳性1例,阴性26例;外周血CTC假阳性2例,阴性25例。3.实验组与对照组胸水“CTC”的比较:实验组胸水“CTC”阳性率(73.9%,34/46)与对照组(11.1%,3/27)相比,阳性率明显更高,2=26.846,P=0.000<0.5,差异具有统计学意义。4.实验组胸水“CTC”与外周血CTC的比较:胸水“CTC”阳性率较外周血CTC阳性率(43.5%,20/46)明显更高,差异具有统计学意义(2=8.788,P=0.003)。5.实验组胸水“CTC”与胸水传统细胞学阳性率的比较:胸水“CTC”阳性率为73.9%,胸水传统细胞学阳性率45.7%(21/46),两者比较2=7.64,P=0.006,差异具有统计学意义。6.胸水“CTC”、外周血CTC、胸水传统细胞学检查三者比较:胸水“CTC”的阳性率和敏感性最高,特异性最低;胸水传统细胞学检查的特异性最高,阳性率和敏感性次于胸水“CTC”;外周血CTC的阳性率、敏感性均次于胸水“CTC”,但特异性高于胸水“CTC”。7.胸腔来源恶性肿瘤与其他部位来源恶性肿瘤所致胸腔积液中,胸水“CTC”阳性率的比较:胸腔来源恶性肿瘤组胸水“CTC”阳性率为58.7%(27/46),其他部位来源恶性肿瘤组胸水“CTC”阳性率为15.2%(7/46),两者比较2=14.988,P=0.000,差异具有统计学意义。研究结论SOP‐im FISH技术能检测出胸水中的脱落细胞,并且与胸水传统细胞学检查及外周血CTC检测相比,胸水“CTC”检测的阳性率、敏感性最高。综合来看,胸水“CTC”诊断恶性胸腔积液的效能最高,其诊断的阳性率为73.9%,敏感性为73.9%,特异性为88.9%。并且与外周血CTC检测相比,胸水“CTC”检测具有更高的恶性肿瘤诊断价值。