感染性腹泻是一种由病原微生物引起的,以腹泻为主要表现的胃肠炎症候群,其中病原微生物主要由细菌、病毒与寄生虫等微生物组成。在我国39种法定传染病中,腹泻发病率高居首位。夏秋季是腹泻的高发季节,但中国南方广州由于温暖潮湿的气候特征,冬春季腹泻病也很常见,而完整的病原谱调查并不多见。作为感染性腹泻病原谱监测平台的哨点医院之一,我们建立了腹泻病原谱监测的技术平台,采用了多种先进的检测技术,如质谱技术鉴定细菌、胶体金免疫层析技术检测轮状病毒抗原和腺病毒抗原以及实时荧光定量PCR技术检测诺如病毒等。本研究通过检测广州市海珠区冬春季腹泻的病原菌及病毒的基因型,以及时了解该地区感染性腹泻的病原谱特征。此外,我们对一些逐渐变得重要的、临床上尚未引起足够重视的病原进行了深入研究,包括：弯曲菌感染患者粪便常规结果的分析、气单胞菌属的进一步鉴定和药敏试验以及病毒的基因分析等等。在进行前一部分研究工作时,我们发现部分严重的腹泻患者一直未找到病源,综合分析其临床资料和查阅有关腹泻的最新进展,怀疑部分患者可能感染了艰难梭菌,因此开展了酶联免疫荧光技术检测艰难梭菌A&B毒素的相关工作,综合分析艰难梭菌A&B毒素阳性患者的临床资料,了解艰难梭菌在腹泻患者中的感染情况,为临床诊治和预防提供依据。本研究分为以下两个章节：第一章广州市海珠区冬春季感染性腹泻的病原学分析南方医科大学珠江医院作为腹泻症候群监测的哨点医院之一,我们收集2012年11月到2013年5月来院就诊的腹泻患者的粪便,通过问卷调查和查阅病历的方式了解病人的基本信息、临床信息以及标本采集情况等,共收集标本290例,其中70例住院和220例门诊,年龄中位数为25个月。按照传染病监测技术平台的要求,监测范围包括细菌病原谱和病毒病原谱。首先,对符合要求的腹泻粪便标本按照腹泻监测平台的要求进行病原菌培养、粪便常规的检查和隐血试验、免疫层析方法检测轮状病毒抗原和腺病毒抗原,同时用冻存管保存5g或5m1左右的粪便于-80℃冰箱；其次,综合分析各平板的菌落情况,挑取多个可疑菌落利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行鉴定；最后,根据鉴定结果,用血清学试验加以确证；气单胞菌属则用其他辅助试验鉴定到种；对-80℃冰箱保存的标本统一用实时荧光PCR进行诺如病毒的检测,并提取病毒阳性标本的核酸利用测序的方法进行基因分型。从腹泻人群分析,以发育情况为标准分为6个年龄组,即婴儿期组、幼儿期组、童年期组、青春期组、成年期组以及老年期组,其中婴儿期组的腹泻人群在所有腹泻人群中所占比重最高而青春期组最低。从腹泻的病原谱分析,腹泻病原总阳性率54.48%(158/290),其中细菌总阳性率为20.67%(60/290)病毒总阳性率36.90%(107/290),混合感染阳性率7.59%(22/290)。病毒总阳性率明显高于细菌总阳性率,各种类型混合感染的阳性率和粪便常规检查结果均没有显著差异。在所检出的病原菌中,沙门菌44.78%(30/67)的构成比居首位,其次为弯曲菌属28.36%(19/67)和气单胞菌属14.93%(10/67),未检测到霍乱弧菌、副溶血性弧菌以及拟态弧菌；在所检出的病毒中,轮状病毒构成比54.86%(62/113)；其次为诺如病毒39.82%(45/113),其中以诺如病毒II更常见；最后为肠道腺病毒4.42%(5/113)。从年龄的角度分析,未成年人细菌的阳性率高于成年人,其中未成年人弯曲菌阳性率明显高于成年人；但未成年人病毒感染的阳性率与成年人之间没有显著差异。从性别的角度分析,男性患者病毒的阳性率高于女性；但男性患者细菌的阳性率与女性之间没有显著差异。从月份的角度分析,细菌阳性率最高在4月份,最低在1月份；病毒阳性率最高在1月份,最低在5月份。对本次病原谱排列前三的病原进一步的分析显示：对于细菌而言,首先对沙门菌,增加了血清学试验和药物敏感试验,结果显示目前引起腹泻28例是A群沙门菌,2例为B群沙门菌,尚未发现其他菌群的沙门菌。28株复苏成功的沙门菌药物敏感试验结果显示,28株沙门菌对2种抗生素完全耐药,占总的抗生素的8.70%；对12种抗生素部分耐药,占52.17%；剩余的9种抗生素完全敏感,占39.13%；28株沙门菌全存在多重耐药的情况；对于弯曲菌,详细分析了弯曲菌感染患者的临床特征,结果显示弯曲菌感染所引起的腹泻粪便中红细胞、白细胞以及隐血试验等三个项目的阳性率明显高于其它细菌引起的腹泻,主要原因是该细菌本身培养的特殊性,较容易被忽略以致于患者未能得到及时有效的治疗所致。10例气单胞菌属结合辅助试验鉴定到种,分别为4株温和气单胞菌,2株嗜水气单胞菌、4株豚鼠气单胞菌,药物敏感试验显示在21种抗生素中,10株气单胞菌对3种抗生素完全耐药,占14.29%：对6种抗生素部分耐药,占28.57%；剩余12种抗生素完全敏感,占41.86%；10株气单胞菌也都存在多重耐药的情况。对于病毒而言,G1P8型轮状病毒是本研究地区的优势株,与G9P8、G2P4和G3P8共占轮状病毒阳性标本的91.94%,其中国内尚未报道G9P4型；GII.4型诺如病毒是最常见的流行株,还发现GI.1、GI.3、GI.4、 GI.6、GI.2、GII.14、GII.G-12型共7种其它基因型,其中国内尚未报道GI.6、GII.g-12型。第二章艰难梭菌在腹泻患者中感染情况的调查从2013年7月到2013年12月,通过问卷调查和查阅病历的方式了解病人的基本信息、临床信息等情况,共收集来院就诊腹泻患者标本137例,其中94例住院和43例门诊；男性84例,女性53例；年龄最大的是85岁,最小的是11天,年龄中位数22岁。当发生腹泻时,首先考虑是常见的病原菌引起的。根据第一章的研究结果显示沙门菌是本次腹泻监测最常见的病原菌,同时该菌因其检测方法简单而能在普通实验室常规开展,故在进行艰难梭菌感染监测之前首先对所有检测的标本先进行沙门菌的筛查。排除沙门菌感染的临床病例,利用酶联荧光免疫分析技术对剩余的标本进行艰难梭菌A&B毒素的检测,结果为8例阳性,对这8例艰难梭菌A&B毒素检测阳性的标本利用加热富集芽孢的方法进行艰难梭菌培养,方法如下：在70℃温浴30分钟后离心,取沉渣接种于厌氧平板后放入装有厌氧产气剂的厌氧袋培养,48小时后进行观察,将培养结果与艰难梭菌A&B毒素的结果进行比较。在收集137例标本中,其中66例儿童,46例青年和25例老人。经筛查,7例为沙门菌阳性。排除7例检出沙门菌的标本,对剩余的130例粪便标本利用酶联荧光免疫分析技术检测艰难梭菌A&B毒素,共检出8例阳性,阳性率为6.15%。8例阳性标本的临床资料分析显示,2例来自消化科,2例来自血液科,2例来自儿科门诊,1例来自肾内科还有1例来自器官移植,科室分布较分散。阳性病例按年龄段分布为儿童3例、中青年3例、老年人2例,以上三组人群的阳性率粪便粪便为4.76%,6.82%和8.70%,经过统计学分析,三类人群的阳性率无显著性差异。对这8例标本的培养结果显示,8例毒素阳性的标本中,6例培养出艰难梭菌,2例未检测到艰难梭菌；8例中有6例的结果一致,酶联免疫荧光法和培养的比对结果良好,进一步体会了艰难梭菌进行厌氧培养对技术和人员等的高标准高要求。相比之下,酶联免疫荧光法更适合临床常规开展。小结根据以上两章节研究结果,小结如下：1、从腹泻的病原谱分析。病原总阳性率和细菌阳性率高于国内的相关报道,其可能原因是本研究采用了先进的质谱鉴定技术；病毒的阳性率高于细菌的阳性率。在所检出的细菌中,前三位分别为沙门菌、弯曲菌和气单胞菌；在所检出病毒中,前三位分别为轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒。2、从腹泻的流行病学分析。针对易感人群,婴儿期组腹泻人群所占比重最大,青春期组则最低。针对性别而言,男性的病毒阳性率高于女性,但细菌阳性率没有显著差异；针对年龄而言,未成年组的细菌阳性率高于成年组而病毒阳性率没有显著差异；针对月份而言,细菌阳性率最高在4月份最低在1月份而病毒阳性率最高在1月份最低在5月份。3、细菌病原谱的新特点。第一、人兽共患病原菌——弯曲菌在未成年组中的阳性率比成年组较高,弯曲菌腹泻患者的粪便常规结果较其他类型腹泻患者严重,建议腹泻未成年人中常规开展弯曲菌的检测工作。第二、人兽共患病原菌——气单胞菌引起的腹泻位居第三位,在感染写腹泻病原菌中处于主要的病原菌,但因所引起的临床症状不严重,较容易被忽视。4、病毒病原谱的新特点。对于轮状病毒而言,G1P8、G9P8、G2P4和G3P8共占轮状病毒阳性标本的91.94%,并发现了国内尚未报道的G9P4型；对于诺如病毒而言,GII.4型诺如病毒是最常见的流行株,还发现7种其它基因型,其中国内尚未报道GI.6、GII.g-12型。5、药物敏感试验的新变化。第一、本次所检测的28株沙门菌和10株气单胞菌全部出现多重耐药。第二、两种细菌对碳青霉烯类、头孢四代、喹诺酮类以及氨基糖苷类所代表的抗生素均完全敏感。第三、沙门菌的耐药情况比气单胞菌严峻。6、艰难梭菌感染易感人群发生的变化。在重点关注住院患者时也要重视社区门诊患者；在关注老年人群时不能忽略儿童艰难梭菌感染相关性腹泻的监测；艰难梭菌感染引起的腹泻患者来自医院多个不同科室,提示艰难梭菌感染可以发生于各种不同疾病不同人群。7、艰难梭菌感染新的检测技术。与培养的方法相比,酶联免疫荧光技术检测艰难梭菌A和(或)B毒素简单、快速、敏感性较高,更适合对腹泻患者进行艰难梭菌感染的筛查。