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目的 通过筛选稳定表达HBx(hepatitis B virus,HBV)基因的肝前体细胞株,进一步构建靶向作用于小鼠肝前体细胞的动物模型。体内研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝前体细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法 通过慢病毒筛选稳转细胞株。2 mL/L四氯化碳每周2次给予昆明小鼠灌胃,4周后行经门静脉注射HBx-14-19细胞和NC-14-19细胞同时切除部分肝脏。术后继续每周2次进行灌胃,并分别于术后3天、5天、7天、14天、21天、28天处死小鼠取肝脏标本;实时定量PCR检测小鼠肝组织HBx的mRNA水平、免疫组织化学染色检测肝组织中外源性细胞的存活。实时荧光定量PCR检测上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和细胞角蛋白18(CK18)mRNA水平,Western blot法检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CK18蛋白水平。结果 1、荧光显微镜下观察HBx-14-19细胞、NC-14-19细胞均可见有绿色荧光表达,传代3次以后其表达量仍为90%以上,证实2种稳定感染细胞均能高表达GFP基因;荧光定量PCR检测HBx基因的mRNA表达结果显示HBx-14-19细胞HBx基因表达明显高于14-19细胞及nc-14-19细胞(p<0.05)。证实稳转株hbx-14-19细胞、nc-14-19细胞构建成功。2、荧光显微镜下观察小鼠不同天数冰冻切片绿色荧光表达情况显示,实验组和对照组术后不同天数均有绿色荧光表达,其表达量随术后天数增加呈增多趋势。3、免疫组化结果显示,术后肝脏组织明显有外源性细胞存活。随注射时间延长,肝组织hbx的含量增加,表达区域增大。4、实时荧光定量pcr检测发现实验组与对照组相比,第3天、5天、7天、14天、21天、28天的肝脏组织中hbx的mrna均有较高表达(p<0.05),随术后时间的进展,hbx的表达含量显著增加。证实动物模型构建成功。5、与阴性对照组相比,在注射含hbx基因的肝前体细胞的实验组不同天数,e-cadherinmrna水平均表现为下降趋势(p<0.05),而n-cadherinmrna在不同天数都表现为增多趋势,术后3天、5天增加最为明显(p<0.05)。vimentinmrna表达呈相对上升趋势,术后7天表达量最高(p<0.01)。ck18mrna在术后实验组与对照组相比整体呈下降趋势,但术后3d表达量显著升高(p<0.05),术后14天、28天下降最为显著(p<0.01),其余均呈下降趋势(p<0.05)。6、westernblot法检测实验组与对照组不同天数emt相关标志物e-cadherin、n-cadherin、vimentin和上皮标志物ck18的蛋白表达水平显示。与阴性对照组相比,在注射含hbx基因的肝前体细胞的实验组不同天数,e-cadherin蛋白含量均表现为下降趋势,14天下降最为明显(3天、5天、7天、14天为p<0.01,21d、28d为p<0.05),而n-cadherin蛋白在术后整体为上升趋势(p<0.05)。vimentin蛋白的表达呈相对上升趋势,术后7天开始表达量明显升高(7天、14天、21天为P<0.01,其余为P<0.05)。CK18蛋白在术后整体呈下降趋势(3天、5天为P<0.05,其余P<0.01)。结论 NC-14-19细胞和HBx-14-19细胞均能稳定表达绿色荧光蛋白,稳转株构建成功;稳定表达HBx基因的动物模型构建成功;本实验通过动物模型证实HBx在肝前体细胞上皮间质转化过程中起着重要的调控作用。