研究背景及目的:创面愈合是医学研究的热点,随着医学的发展,人均寿命延长,老年人越来越多,且人民对于美的需求也不断提高,关于局部慢性、难愈合创面的就医需求提升。然而创面愈合仍有许多难题尚待解决,这与人民群众的需求存在差距。在创面的愈合过程中会经历炎症期、纤维增生期和重塑期3个阶段,此过程包括肉芽组织的形成和创面的再上皮化,是一个复杂而连续的过程,机制尚未完全阐明。表皮角质形成细胞的迁移对创面愈合有重要意义,离不开细胞骨架的参与,是个动态而复杂的过程。细胞骨架的组成主要是微管、中间丝和肌动蛋白丝这三个部分,微管是含有α-tubulin和β-tubulin两个亚基的异二聚体,其结构在聚集和解聚之间处于动态平衡,并受许多调节因子的影响,对细胞迁移起着重要的调控作用。表皮角质形成细胞的增殖、凋亡与分化贯穿于整个皮肤的正常生理活动,与角质形成细胞的迁移一起协同调控创面愈合的全过程。维生素D是一种脂溶性激素,不仅钙和磷平衡调节有关,也保证了包括皮肤在内的主要人体器官的正常功能。现已知的维生素D有多种,其中活性最高的是维生素D3。皮肤在紫外线（UVB 280-320nm）作用下其中的7-脱氢胆固醇（7-DHC）生成维生素D3,后者在人体内经过两次羟基化转化为其生物活性形式的1,25-二羟基维生素D3（1,25（OH）₂D₃,骨化三醇,以下简称VD3）。VD3的产生既依赖皮肤,也作用于皮肤。有研究发现口服或局部使用VD3均增强了伤口愈合能力,且VD3缺乏与慢性创面愈合不良有关,而缺乏维生素D是个普遍的现象。皮肤表皮层位于真皮层上方,依靠真皮层提供营养,无直接供血,体内合成的VD3无法通过血液循环直接来到皮肤表皮层,因而血清生理浓度VD3不能反映表皮真实VD3浓度,且表皮局部VD3浓度可通过外用VD3来提高,目前表皮VD3的生理浓度尚无一个完整的标准。结合相关研究支持,我们认为维生素D3在创面愈合过程中起着重要的作用,为观测VD3培养条件下角质形成细胞迁移能力的变化,探讨微管动力学在VD3调控角质形成细胞迁移过程中的作用,并研究VD3对于人角质形成细胞迁移、增殖、凋亡与分化的影响。我们选择人永生化角质形成细胞株（HaCaT细胞）,将HaCaT细胞培养在含高浓度VD3（100nmol/L、10nmol/L）、血清生理浓度VD3(10^-1 nmol/L)和低浓度VD3(10^-3nmol/L及10^-5nmol/L)的培养液中,通过细胞划痕实验和采用活细胞工作站检测细胞迁移能力,通过WB实验及免疫荧光染色实验研究VD3对HaCaT细胞迁移的影响和HaCaT细胞微管动力学的变化,通过流式细胞仪分析,CCK-8实验和WB实验等方法研究VD3对HaCaT细胞增殖、凋亡、分化和细胞周期的影响,并初步探索其机制。研究方法:本研究共分为两个部分:第一部分:VD3对HaCaT细胞迁移能力的影响的实验研究。（1）观察VD3培养条件下HaCaT细胞迁移能力的变化1.设置不同浓度VD3组:对照组:0nmol/L,高浓度组:100nmol/L、10nmol/L,血清生理浓度组:10^-1nmol/L,低浓度组:10^-3nmol/L及10^-5nmol/L,各组培养液分别培养贴壁后的HaCaT细胞,培养时间为24h和48h。2.通过划痕实验观测各组HaCaT细胞迁移的变化情况。3.通过活细胞工作站实验观察各组HaCaT细胞的移动速度和范围的变化。（2）观察VD3培养条件下HaCaT细胞微管动力学的变化1.通过免疫荧光染色实验观测各组HaCaT细胞α-微管蛋白（α-tubulin）的表达。2.通过WB实验检测各组HaCaT细胞游离态α-tubulin和聚合态α-tubulin的表达。第二部分:VD3对HaCaT细胞增殖和分化的影响的实验研究。（1）观察VD3培养条件下HaCaT细胞增殖的变化情况1.设置不同浓度VD3浓度组,分组和培养条件同上。2.通过CCK-8实验分析各组HaCaT细胞增殖的变化情况。3.通过WB实验检测各组HaCaT细胞内细胞增殖标志蛋白的表达。（2）观察VD3培养条件下HaCaT细胞凋亡的变化情况1.通过流式细胞仪分析各组HaCaT细胞凋亡的情况。2.通过WB实验检测各组HaCaT细胞内细胞凋亡标志蛋白的表达。（3）观察VD3培养条件下HaCaT细胞周期的变化情况1.通过流式细胞仪分析各组HaCaT细胞的细胞周期。2.通过WB实验检测各组HaCaT细胞内细胞周期蛋白的表达。（4）观察VD3培养条件下HaCaT细胞分化的情况1.通过WB实验检测各组HaCaT细胞内细胞分化标志蛋白的表达。结果:1.通过细胞划痕实验和活细胞工作站发现:跟对照组相比,高浓度VD3组中HaCaT细胞的迁移能力下降,血清生理浓度VD3组中HaCaT细胞的迁移能力提高,低浓度VD3组中HaCaT细胞迁移能力无明显变化。2.通过WB实验和免疫荧光实验观察HaCaT细胞内α-tubulin的表达变化发现:跟对照组相比,高浓度VD3组HaCaT细胞内微管更倾向于聚合状态,血清生理浓度组VD3细胞内微管更倾向于解聚状态,低浓度VD3组细胞内微管状态无明显变化。3.通过CCK-8实验和WB实验发现,跟对照组相比,各浓度VD3组HaCaT细胞的增殖能力提高,同时PCNA的表达也升高。4.通过流式细胞仪分析HaCaT细胞周期发现:各浓度VD3组细胞周期各时期的比例无明显差异;WB实验检测Cyclin A2和Cyclin B1的表达发现:与对照组相比,各浓度VD3组HaCaT细胞中Cyclin B1的表达升高,Cyclin A2的表达无明显变化。5.通过流式细胞仪及WB实验分析HaCaT细胞的凋亡发现:与对照组相比,高浓度VD3组HaCaT细胞的凋亡率上升,同时Bax的表达升高,Bcl-2的表达降低,Bax/Bcl-2的比值升高,血清生理浓度组及低浓度组HaCaT细胞的凋亡率降低,同时Bax的表达下降,Bcl-2的表达提高,Bax/Bcl-2的比值降低。6.通过WB实验检测HaCaT细胞内Involucrin和CK14的表达发现:跟对照组相比,高浓度和低浓度VD3组HaCaT细胞中Involucrin的表达升高,高浓度VD3组HaCaT中CK14的表达升高。结论:1.VD3通过改变HaCaT细胞内α-tubulin的表达,同时调节微管聚合/解聚的平衡,进而调控HaCaT细胞的迁移。2.VD3促进HaCaT细胞内DNA的合成,上调Cyclin B1的表达,同时促进HaCaT细胞增殖。3.VD3对HaCaT细胞周期各时期的比例无明显影响。4.高浓度组VD3促进HaCaT细胞的凋亡,血清生理浓度及较低浓度VD3抑制HaCaT细胞的凋亡。5.血清生理浓度VD3对HaCaT细胞晚期分化无影响,高浓度组VD3和低浓度组VD3均能促进HaCaT细胞晚期分化。