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恶性肿瘤是危害人类健康和生命的头号杀手,许多细胞因子与恶性肿瘤密切相关。大量研究发现,肿瘤细胞自身分泌或接受致炎因子(TNF-a等)刺激后产生的细胞因子IL-6,与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及化疗抵抗作用等预后不良密切相关。在查阅大量文献和原有工作的基础上,本研究应用RNA干涉(siRNA)、基因克隆、基因转染、Western-blot、荧光实时定量PCR、RT-PCR和ELISA技术,探讨有丝分裂原激活的蛋白激酶MEKK3在TNF-a刺激后的恶性肿瘤细胞所产生的IL-6中的作用,旨在为阐明恶性肿瘤细胞中TNF-a介导的IL-6产生的机制和发现可能的治疗药物作用的靶点奠定基础。肺癌是高度恶性的肿瘤,其死亡率占恶性肿瘤的第一位；乳腺癌是世界各地女性中最为常见的恶性肿瘤,也是导致女性死亡的主要原因之一。因此,本课题选择肺癌和乳腺癌细胞进行研究。本研究第一部分首先应用ELISA方法检测肺癌A549细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞接受TNF-a刺激后IL-6的产生。结果表明：在接受TNF-a刺激后,A549细胞和MDA-MB-231细胞均能产生较高水平的IL-6。在此基础上,应用Western-blot和RT-PCR方法分别检测了A549细胞和MDA-MB-231细胞接受TNF-a刺激后MEKK3的磷酸化及MEKK3基因表达的改变,以判断其是否是TNF-a信号途径的成分。Western-blot结果表明：A549细胞接受TNF-a刺激后10min,MEKK3即发生磷酸化,30min达高峰,2h后恢复正常；MDA-MB-231细胞接受TNF-a刺激后30min发生磷酸化,1h达高峰,2h后亦恢复正常。RT-PCR结果显示：与未刺激的样本对比,两种细胞接受TNF-a刺激后,MEKK3 mRNA表达均明显增加。Western-blot结果和RT-PCR结果均表明：MEKK3可被TNF-a激活、MEKK3是TNF-a信号途径的信号分子,其接受TNF-a刺激后磷酸化的出现与改变及其mRNA表达的改变相似于文献报道的其他蛋白激酶因接受细胞因子刺激而活化后的磷酸化和基因表达的改变。以第一部分的结果为依据,本研究的第二、三、四部分着眼于探讨MEKK3是否参与TNF-a刺激后恶性肿瘤细胞所产生的IL-6的调控。本研究第二部分应用Ambion公司siRNA设计软件设计针对MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,在体外合成相应的DNA片段后,以BamHI及HindⅢ酶切位点分别克隆入pSilencer 4.1-CMV hygro载体,构建成四个针对MEKK3基因的siRNA表达载体—pSilencer4.1-MEKK3siRNA,再以脂质体(Lipofectamine2000)分别将其转染入A549细胞,应用Western-blot检测MEKK3 siRNA表达载体对MEKK3表达的抑制。结果发现,四个MEKK3 siRNA表达载体对MEKK3的表达均有抑制作用,其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制作用最为显著,抑制率达84%,因此选择将其分别转染入A549和MDA-MB-231细胞,潮霉素筛选后获得的抗性细胞克隆株,经荧光实时定量PCR测定后,结果显示MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231稳定克隆株中MEKK3的表达均获得了80%以上的抑制,保证了后续的研究。本研究第三部分首先应用RT-PCR,扩增MEKK3基因的全长cDNA序列,通过KpnI和XhoI酶切位点克隆入pcDNA3.1/hygro(+)载体中,构建pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表达载体,并转染入A549和MDA-MB-231细胞中。Western-blot结果显示MEKK3蛋白在此两种细胞中均表达良好。应用潮霉素筛选获得的两种细胞的稳定细胞克隆株,经荧光实时定量PCR检测后发现,其MEKK3 mRNA的表达水平与空载体稳定细胞克隆株相比,均有显著增加(分别增加了195%和177%)。结果表明pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表达载体构建成功,且成功地获得了MEKK3高表达稳定细胞克隆株,进一步保证了后续的研究。本研究第四部分分别应用RT-PCR和ELISA检测TNF-a刺激未转染的A549和MDA-MB-231细胞(野生株)、MEKK3低表达的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231稳定细胞克隆株、将MEKK3基因重新转染入MEKK3低表达的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231并经RT-PCR验证恢复了MEKK3表达的细胞、A549和MDA-MB-231siRNA阴性对照稳定细胞克隆株、MEKK3高表达的稳定克隆株及pcDNA3.1空载体稳定细胞克隆株中IL-6的表达或产生。结果表明：MEKK3低表达的MEKK3siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231稳定细胞克隆株IL-6 mRNA的表达及IL-6的产生均明显低于野生株或阴性对照克隆株,差异非常显著(P均<0.01)；此两细胞株恢复MEKK3表达后,其IL-6mRNA的表达和IL-6的产生均获得了大幅度的提高,其结果高于野生株或阴性对照克隆株,差异非常显著(P均<0.01)；A549和MDA-MB-231 MEKK3高表达稳定细胞克隆株接受TNF-a刺激后,其IL-6的产生均明显高于两者的野生株或空载体对照株,差异非常显著(P<0.01)。初步结果提示：MEKK3是TNF-a介导的肺癌和乳腺癌细胞中IL-6产生的信号转导途径的重要成分,MEKK3与TNF-a介导的肺癌和乳腺癌细胞中IL-6的产生密切相关,并在TNF-a介导的肺癌和乳腺癌细胞产生IL-6中起重要的调控作用,其下游信号途径有待进一步研究。