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γ-氨基丁酸(GABA)是一种普遍存在于自然界中的非蛋白质类的氨基酸,它可由谷氨酸或其钠盐经谷氨酸脱羧酶(GAD)在一些辅因子的辅助下催化转化而来。GABA具有使血压降低、治疗癫痫类疾病、保肝利肾、预防哮喘、调节激素的分泌水平、镇静安神、增强记忆力等重要的生理功能。本论文利用微生物发酵生产GABA,具有安全系数高、成本低的特点,首先,以基因工程技术为基础,构建能够高效表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌。其次,采用固定化技术,利用固定化的GAD发酵生产GABA,避免直接用工程菌生产GABA带来的安全隐患。最后,通过固定化酶的反复使用有效降低生产成本。本研究首先从Lactobacilus plantarum22144和E.colZ AS1.505中分别克隆gad基因,构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad),两种工程菌经IPTG诱导后,都能够表达GAD蛋白,其分子量均在53kDa左右,但基因序列差别很大,同源性仅58%,氨基酸序列相似性更低,为45%。通过HPLC比较E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)的谷氨酸脱羧酶酶活力,最终选择酶活力较高的E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)作为研究对象。利用信号肽分泌表达、与融合标签融合表达和与分子伴侣共表达3种在大肠杆菌中提高外源蛋白可溶性表达的策略,分别构建了 E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad);E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad,△pe1B);E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144-gad);E.coli BL21(DE3)(pMA-c2X-22144-gad(TGA));E.coli BL21(DE3)(pET-28a-SUMO-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)共 6 株重组大肠杆菌。通过比较重组蛋白的可溶性表达量及酶活力高低,发现E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES,pET-28a-22144-gad)可以提高 GAD 的可溶性表达,且酶活力最高,在酶活测定条件下对MSG的转化率可达95%以上,确定利用其表达外源蛋白GAD。为提高E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL ES,pET-28a-22144-gad)对GAD的可溶性表达,及提高细胞破碎率,减少细胞破碎对酶活性的损害,对诱导温度、IPTG添加量等诱导表达条件和破碎缓冲液进行了优化,最后获得的诱导及破碎条件为:IPTG添加量为0.1mM,诱导温度25℃,140rpm诱导表达10 h后,每5 OD600离心后的菌体加0.5 mL TGE缓冲液进行超声破碎。对超声破碎处理得到的GAD粗酶液的酶学性质进行研究,其酶的最适催化pH=4.6,最适催化温度为37℃,酶活力可达1.86 U/mL。分别用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、环氧基树脂和氨基化树脂对酶进行固定化,结果表明氨基化树脂LX-1000EA在pH4.6的缓冲液中对酶固定化效果最好,可以达到约50%的酶回收率。通过单因素实验和Box-Benhnken试验设计对酶固定条件进行优化,得出用氨基化树脂LX-1000EA固定谷氨酸脱羧酶的最佳条件为:固定化时间7.5h、固定化温度42℃、载体g:酶U=1:7.5,酶活力可达4.22±0.1U/g。固定化酶IGAD的酶学性质为最适催化pH=4.8,比游离酶(pH=4.6)偏高;在PH=3-5的偏酸性条件下,酶的稳定性较强;IGAD的最适催化温度与游离酶相似,为37℃,该条件下酶活力约4.4 U/g;酶的热稳定性较好,在45℃保存8 h仍保留80%的酶活,但温度越高酶活丧失越严重。所以IGAD应在偏酸性低温(4℃)条件下保存。最后利用IGAD在3 L发酵罐里转化生产GABA,通过分批添加MSG,转化72h后,GABA产量可达117 g/L,转化率达97%,再经下游分离纯化工艺处理后,即可符合工业生产的要求。