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本论文目标是制作单分子DNA芯片,首先,在硅基表面旋涂电子束抗蚀剂聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA),电子束曝光(electron beam lithography,EBL)制备高密度纳米坑阵列,通过化学表面修饰,将一端带有生物素(biotin),另一端带有Cy3荧光基团的单个DNA固定至链霉亲和素(streptavidin,STV)修饰的纳米坑底部,这种定点固定单分子DNA芯片的研制方法,可克服随机铺设单分子随机性大、基片利用率低的问题,可为制备新型单分子DNA芯片提供参考。本文探索到一种快速有效的硅片清洗方法,初步获得大量制备STV-1DNA复合物的条件,并运用EBL制备高密度纳米坑阵列,主要包括以下几个方面的工作:(1)硅片表面的化学修饰与DNA分子的表面固定:利用化学清洗剂和水虎鱼溶液清洗硅片,去除硅片表面杂质,经荧光显微镜观测,证明该方法简单快速,并能有效降低基底背景。将水虎鱼溶液处理后的硅片用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES)和1,4-亚苯基二异硫氰酸酯(1,4-Phenylene diisothiocyanate,PDITC)处理,并利用生物素-链霉亲和素系统将一端带有biotin、另一端带有Cy3荧光基团的DNA固定至硅基底表面,全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscope,TIRFM)进行观测。结果表明,该方法能够有效固定DNA分子,为在硅基底上制备单分子DNA阵列进行了第一步尝试。(2)STV-1DNA复合物的制备:基于生物素-链霉亲和素系统的特点,将一端由biotin修饰的500 bp双链DNA与STV混合,制备不同的DNA-STV复合物,并用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)表征。同时,对不同DNA:STV摩尔比和孵育时间获得的混合复合物进行琼脂糖凝胶电泳分离,比较电泳结果,探索大量制备STV-1DNA复合物的条件。(3)纳米坑阵列的制备:在硅片表面旋涂PMMA,EBL制备高密度纳米坑阵列,并利用扫面电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)进行表征,初步获得高分辨率高密度纳米坑阵列。纳米坑底部进行选择性化学修饰,将一端带有biotin、另一端带有Cy3荧光基团的DNA固定至纳米坑底部,尝试制备单分子DNA芯片,利用TIRFM进行观测。