脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)救治修复的关键是如何促进其功能的恢复。大量实验研究表明细胞替代、增强神经元再生潜能、克服再生抑制因素等方法对损伤脊髓功能恢复有一定的促进作用，但距离临床应用尚存在很大差距。同时临床和实验的证据显示SCI后常伴有一定程度的功能恢复，残存的脱髓鞘轴突和出芽轴突在功能恢复中起重要作用。因此，增强损伤脊髓固有可塑能力是促进功能恢复的重要手段。 研究发现SCI后功能损害的同时，少突效质细胞(oligodendrocyte,ODC)明显减少，而功能代偿出现时，则见ODC数目增加。移植具有成髓潜能的细胞(如Schwann细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞等)，对受损脊髓的功能改善更为明显。本室的研究表明腺病毒介导的BDNF基因转移导致的SCI功能修复主要是通过其促髓鞘形成作用来实现的。可见，促进受损脊髓的髓鞘再形成，是加速SCI功能修复的重要策略。要达到这一目的，最直接的手段是移植ODC，但由于其是成熟的细胞，不能在离体条件下扩增，因此，大多数研究用ODC的前体细胞，包括原代培养的O2A祖细胞和CG-4细胞系。实验证实，这些细胞体内移植可分化为ODC，并有髓鞘形成能力，但是由于其髓鞘形成的区域有限(＜2mm)，使得功能的改善并不显著。其原因是这些细胞在移植部位的迁移能力不足而扩散受限。因此，增加这些细胞的迁移能力将是克服功能修复问题的关键。 p75NTR作为神经营养因子的共同受体，已证实介导Schwann细胞的迁移。外周轴突损伤，通过p75NTR的高表达，使Schwann细胞迁移能力增强，有助于成功的再生。因此，利用p75NTR基因修饰O2A祖细胞并移植到受损脊髓部位，是否会产生类似Schwann细胞在周围神经再生中的作用，是一个令人感兴趣的重要问题。 为此，本研究采用修饰的贴壁差异法进行OZA祖细胞的纯化，用免疫细胞化学和诱导分化对其鉴定，用改良培养基进行扩增；利用基因工程技术，以Cre／loxP介导的细胞内同源重组方法构建了含不同启动子的p75NTR和EGFP腺病毒载体，完成对OZA祖细胞修饰后，观察了移植修饰细胞对受损脊髓功能修复的影响。主要结果及结论如下： 1．新生大鼠大脑皮层的原代混合胶质细胞培养，用修饰的贴壁差异法进行分离纯化后，免疫细胞化学染色证实纯化细胞有特征性标记AZBS，血清可诱导其分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞，T3则刺激其向少突胶质细胞分化。说明纯化的细胞为OZA祖细胞，并具有定向分化能力。 2．OZA祖细胞可在星形胶质细胞条件培养基中存活、增殖，表明星形胶质细胞条件培养基含有OZA祖细胞的有丝分裂原。免疫细胞化学染色发现，培养条件下，少突胶质细胞有一定水平的p75NTR表达，而OZA祖细胞几乎无p75NTR阳性显色。 3．用分子克隆技术成功构建了含CMV或MBP启动子的穿梭质粒：pCMV－p75－shuttle、pCMV－EGFPsnuttle、pMBP－p75－shuttle、pMBPEGFP－shuttle；并完成了扩增腺病毒基因组质粒的氯化铝法纯化和酶切鉴定。用Cre／loxP介导的细胞内同源重组方法结合现代病毒学技术制备了高滴度的重组缺陷型腺病毒载体AdCMV中75、AdCMV－EGFP、AdMBP巾75、AdMBPEGFP，分别在DNA、RNA和蛋白质水平用PCR、RT．PCR、免疫细胞化学／间接免疫荧光方法对载体进行了鉴定，证明构建载体含有目的基因并具有生物活性。转染混合胶质细胞培养的结果及脊髓内直接注射的表达分析显示AdMBP巾75、AdMBPEGFP介导目的基因仅在少突胶质细胞内表达，表明MBP启动子的特异性。 4．结合荧光金逆行示踪技术，发现腺病毒载体介导的p75NTR过表达并不诱导脊髓运动神经元凋亡。用＊d＊＊V巾75、＊此＊爪＊0P分别转染OZA祖细胞，发现p75NTR基因修饰的细胞有分化迹象，且可见部分修饰细胞有丝状伪足样结构。提示p75NTR可能参与OZA祖细胞的发育及迁移。 ·VI· 5．用成年大鼠颈髓皮质脊髓柬横断损伤模型，结合行为学检测、FG 和BDA示踪、免疫细胞化学及病理学检测，观察p75NTR基因修饰的OZA 祖细胞移植对受损脊髓的影响。发现修饰细胞无转移基因的渗漏性表达， 对皮层投射神经元的存活无明显影响，移植细胞可迁移进入损伤区周围， 并发挥髓鞘形成作用，明显促进损伤脊髓的功能恢复。在细胞移植后4周， 损伤区内未发现BDA标记纤维，可能对轴突的再生不产生显著影响。损 伤区周围未见明显的致密网状GFAP及nestin染色，表明移植的细胞并不 导致星形胶质化。