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背景HBV感染慢性化进程中,CD4+T细胞发挥重要的免疫调控作用,并因其亚群多样性可对肝纤维化进程产生不同的影响。前期研究中发现慢性乙肝患者体内,Treg/Th17比率随着肝损伤和肝纤维化程度加深而降低。而T淋巴细胞本身也存在一个被调节的过程,T淋巴细胞程序性细胞死亡是免疫调节的主要途径,包括细胞凋亡(apoptosis)与自噬(autophagy)等。其中自噬是胞内双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。有研究认为,T淋巴细胞及其亚群通过自噬来达到免疫稳态。近年来,实质细胞的自噬在病毒感染、肿瘤疾病进展以及药物抵抗等方面的研究己经取得一定程度的进展。而新近报道,在HIV感染中发现存在CD4+T细胞的自噬现象,那么在HBV感染慢性化进程中是否存在CD4+T细胞自噬功能的改变、改变受肝脏微环境何种因素影响及相关的信号通路尚不明确。方法1.HBV感染慢性化进程中的CD4+T细胞自噬现象观察分离携带者、慢性乙型肝炎(CHB)及乙肝后肝硬化(LC)患者外周血单个核细胞(PBMC),流式细胞术分选纯化患者外周血CD4+T细胞。采用电镜观察CD4+T细胞自噬过程中的包裹胞内容物的双层膜结构,在细胞超微结构水平明确疾病进程中CD4+T细胞自噬功能的改变；采用细胞免疫荧光法直观检测CD4+T细胞中LC3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3)的定位及表达。采用多色流式细胞术(指标包括CD4、LC3B),分析外周血CD4+T细胞自噬活动的表达情况,以及Western blot分析疾病进程中CD4+T细胞自噬特异性蛋白LC3II/LC3I相关蛋白(Atg5、Atg7和Beclin-1)以及降解蛋白p62变化情况。2.CD4+T细胞自噬活动影响因素的体外研究ELISA检测慢性乙型肝炎患者体内血清HMGB1表达,并对HMGB1与外周血CD4+T细胞自噬做相关性分析；收集不同分级分期的慢性乙型肝炎患者肝穿刺标本,采用免疫组化法分析肝脏HMGB1表达：免疫荧光法检测局部CD4+T细胞的自噬特异性蛋白表达,从组织学水平证实肝组织局部CD4+T细胞的自噬现象。利用HBcAg、r-HMGB1刺激CHB组(病理分期S2-3及S4)患者外周血分离出的CD4+T细胞,多色流式细胞术检测这两种代表HBV感染慢性化进程中的不同致病因素对CD4+T细胞自噬功能的影响；采用序贯刺激方法,模拟疾病进展,进一步观察其对CD4+T细胞自噬活动的改变；自噬与凋亡关系错综复杂,为了更纯粹的分析细胞自噬的相关影响因素,我们利用AnnexinV-PI染色分析细胞凋亡情况。3. HMGB1影响CD4+T细胞自噬功能的信号通路研究HMGB1刺激CD4+T细胞前后,流式细胞术检测HMGB1受体的表达量(指标包括TLR2、TLR4、RAGE),分析刺激物是否改变受体表达；流式细胞术胞内染色检测HMGB1下游的信号分子磷酸化表达情况(指标包括p-JNK、p-AKT、 p-P38、p-ERK);加入相关受体拮抗剂或信号分子拮抗剂后,流式细胞术分析LC3B表达量以及上述信号分子的磷酸化表达情况,分析受体以及介导的信号通路对自噬活动的影响。结果1.HBV感染慢性化进程中的CD4+T细胞自噬现象观察多色流式细胞术检测结果显示：外周血LC3/CD4+T比值(即CD4+T细胞中发生自噬活动的细胞比例),在HBV感染慢性化进程中持续升高,而慢性乙型肝炎进展至肝硬化阶段,其CD4+T细胞自噬水平下降。Western blot结果进一步表明,自噬特异性蛋白(LC3II/LC3I)以及相关蛋白(Atg5、Atg7和Beclin-1)表达量在疾病进展中逐渐增加,CHB进展至LC阶段表达下调,而自噬降解蛋白p62的表达与上述蛋白趋势冶好相反,表明无论流式细胞检测还是Western蛋白表达分析,CD4+T细胞自噬改变趋势一致。将携带者、CHB和LC组,再根据病毒、炎症、HBeAg表达、GS分期进行亚组分析,发现HBV病毒载量越高,炎症程度越高,CD4+T细胞自噬活动增强；而临床上用来一定程度上反应病毒复制的HBeAg指标,对细胞自噬无明显改变。对S2-3期慢乙肝患者按照G分期的不同进一步分组后分析发现,外周血CD4+T细胞自噬随着G分期的增加而增加；同样的对G2-3期进一步分析发现,随着S分期(纤维化程度)的增加,外周血CD4+T细胞自噬表达也显著增多,但S4期与S2-3期比较无统计学意义上的增加。而乙肝后肝硬化患者外周I[11CD4+T自噬现象,随着Child分期评分的增加呈现出明显增高趋势。2.CD4+T细胞自噬活动影响因素的体外研究慢性乙型肝炎过程中,HMGB1水平随S分期增加而增高,且与CD4+T细胞自噬之间存在显著正相关,提示HMGB1可能是影响CD4+T细胞自噬的一个重要因素。透射电镜检测和多色流式细胞术结果显示：单独给予HBcAg或IMGB1刺激,CD4+T细胞自噬表达增多；给予HBcAg和(?)HMGB1序贯刺激后,CD4+T细胞自噬表达较HBcAg单独刺激明显增加,但三组比较,细胞凋亡活动无明显差异。3. HMGB1影响CD4+T细胞自噬功能的信号通路研究HBV感染慢性化进程中呢,CD4+T细胞表面TLR2、TLR4、RAGE表达均无明显变化,给予HMGB1刺激后,仅RAGE表达增多,提示RAGE可能参与HMGB1促进自噬。给予RAGE中和性抗体,自噬活动相较于HMGB1刺激组减弱,磷酸化JNK/ERK表达也降低,而p38MAPK和AKT没有明显表达异常。结论在HBV感染慢性化进程中发现存在外周血CD4+T细胞自噬现象,表现为：CD4+T细胞自噬水平伴随CHB患者血清病毒复制、肝组织炎症及纤维化炎症程度加重而增高；同时,LC患者肝功能Child分期的增加自噬现象愈为明显。HBV病毒本身(HBcAg)和炎症因素(HMGB1)均能有效的促进外周血CD4+T细胞自噬增加,尤以后者更为明显并存在叠加效应,而对细胞的凋亡无明显影响。其中HMGB1通过RAGE介导的JNK/ERK信号通路轴,影响CHB患者外周血CD4+T细胞自噬功能。