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[研究背景]黄酮类化合物广泛存在于天然植物中,是许多中草药的有效成分,具有多种药理活性。对黄酮进行结构修饰是提高其生物活性和获得新活性化合物的重要途径,黄酮磷酸化修饰还可改变其母体分子的某些物理和化学性质,增强或减弱分子间相互作用,因此黄酮磷酸化修饰可提高水溶性和生物利用度。黄酮的磷酸化修饰已经引起药物化学家的重视,并在抗癌作用方面进行了研究,但作为胆固醇酯酶抑制剂、对血清酶的影响以及与血清白蛋白的相互作用还未见报道,这些作用的机理及其构效关系还不清楚。[目的]通过对黄酮进行磷酸化修饰,优化修饰途径以获得高收率；筛选高活性胆固醇酯酶抑制剂；分析磷酸化修饰黄酮对8种重要血清酶活性的影响；分析磷酸化修饰黄酮与血清白蛋白的结合能力、结合方式、结合位点,并分析这些作用的机理及其构效关系。[方法]本研究以木犀草素、芹菜素、白杨素、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮为材料,以C1P(O)(OEt)2为磷酸化试剂、DMAP作为催化剂,加入Et3N在THF中获得黄酮磷酸化修饰衍生物,通过硅胶柱分离得到磷酸化修饰黄酮化合物,通过NMR、MS、IR和元素分析进行结构鉴定。应用Hosie法测试黄酮及磷酸化修饰黄酮对猪胆固醇酯酶的抑制活性,并分析其作用机理；应用全自动生化分析仪检测磷酸化修饰黄酮对8种血清酶的活性影响,对胆碱酯酶抑制活性进行了IC50计算,分析其抑制活性的构效关系；应用荧光光谱、紫外-可见光谱分析磷酸化修饰黄酮衍生物与HSA与BSA的结合方式、结合距离、结合位点、金属离子对结合力的影响及结合力与磷酸化修饰黄酮结构的关系。[结果](1)获得了6种磷酸化修饰黄酮2a、2b、2c、2d、2e、3c和一种磷酸化修饰黄酮钠盐3a,通过条件优化,产率分别达到90.3%、83.0%、86.3%、80.2%、73.5%、65.8%、57.4%,其中2a、2b、2e、3a为新化合物。在C1P(O)(OEt)2、Et3N、DMAP的作用下首次以较高产率成功的获得了木犀草素、芹菜素等化合物中多个羟基完全被磷酸化的化合物。(2)黄酮磷酸化之后pCE抑制活性大大提高,按照活性大些排序为3c>2d>3c>2a>2b> 2e>3a, IC50值分别为0.75 nM、2.44 nM、3.76 nM、3.89 nM、26.1 nM、0.39μM和50.6μM,3c、2d、3c、2a、2b有着良好的CE抑制剂前体药物开发前景。2a、2b、2c、2d、3c均为pCE的混合型抑制剂,而2e为反竞争型抑制剂。所有磷酸化修饰黄酮对pCE的抑制作用均为不可逆抑制,且2d、2c、3c在作用过程中均有极性较大的中间化合物生成。而2a、2b、2e没有生成中问化合物。构效关系分析表明7-位磷酸化修饰使抑制活性增强,5.位修饰降低了活性,4’-位修饰显著降低活性。(3)6种磷酸化修饰黄酮对ALT、AST、LDH、ALP、γ-GT、CK、α-HBDH等7种血清酶的活性影响很小,没有超出正常范围值。但能显著降低胆碱酯酶(CHE)的活性,IC50为0.00006 nM～89.45650 nM,抑制活性大小顺序为2c>3c>2a>2b>2d>2e。构效关系表明为,7-位修饰提高抑制活性,5-位修饰起到协同促进作用,B环上的羟基磷酸化修饰也能提高活性,且随修饰基团数增多而提高活性。6-位磷酸化修饰活性显著降低。(4)6种磷酸化修饰黄酮与HSA、BSA的猝灭都是一个静态猝灭过程,结合过程中发生为非辐射能量转移,与HSA和BSA的结合力主要是通过静电吸引所产生的力。且随着温度升高,结合常数降低,以3c结合常数下降最快,对温度变化最为敏感：2c、2d、2e与BSA结合能力比HSA强,表明修饰位点越多,结合力越大；5位、7位羟基同时磷酸化修饰后与血清白蛋白结合能力显著增强,5位修饰结合力>6位修饰结合力>7位修饰结合力,5位是与血清白蛋白结合的关键位点。结合位点为SiteⅠ型(保泰松的结合位点)。以2c、2e与血清白蛋白的结合距离较大,其它的都比较小。同种化合物与HSA、BSA的结合距离差异很小。A环5-位、6-位羟基磷酸化修饰有利于与HSA的结合,7-位羟基磷酸化修饰对与HSA的结合贡献较小,而7-位羟基磷酸化有利于与BSA的结合,5-位羟基与6-位羟基磷酸化修饰不利于与BSA结合；B环上3’-羟基磷酸化修饰都有利与HSA和BSA的结合。金属离子对血清白蛋白与磷酸化修饰黄酮结合都存在一定影响,其中Cu2+、Al3+影响最大,与药物显著竞争结合蛋白的结合位点,延长这些化合物在血清中的存留时间,对药物的药效有增强作用；K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+对结合影响较小。[结论](1)通过优化条件,选择合适的催化剂,获得了通用的磷酸化黄酮衍生物高效修饰途径；(2)黄酮的磷酸化修饰获得了高胆固醇酯酶抑制活性新功能,且活性与结构关系密切,为胆固醇酯酶抑制剂的研发提供新思路；(3)磷酸化修饰黄酮对ALT、AST、LDH、ALP、γ-GT、CK、α-HBDH等血清酶的活性影响很小,但是对CHE的抑制活性极强,且呈构效关系：(4)磷酸化修饰黄酮与HSA、BSA具有较强的结合力,结合力大小与结构存在一定关系,结合位点属于SiteⅠ型,证明磷酸化修饰黄酮具备药物在血液中运输的基本特征。