α-地中海贫血(α-地贫)是一组由于α-珠蛋白基因缺失或突变使α-珠蛋白链合成不足或缺乏而引起的遗传性溶血性贫血,是人类最常见的单基因疾病之一。临床上将α-地中海贫血分为静止型携带者、α-地中海贫血特性、Hb H病和血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征。血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征又称重型α-地中海贫血,主要由于缺少4个α-基因引起。因α-珠蛋白链合成完全缺乏,从而导致胎儿严重贫血。若不进行宫内治疗,胎儿多在孕晚期死亡或出生后数小时死亡。重型α-地中海贫血是一个重要的全球性健康问题。诱导多能干细胞(i PSCs)是可以通过在已分化的体细胞中同时表达在胚胎干细胞(ESC)中通常以高水平表达的几种转录因子而产生的一种多能干细胞。该干细胞与胚胎干细胞相似,具有自我更新和向三个胚层分化的能力。因此,诱导多能干细胞的产生可以避免使用胚胎干细胞带来的伦理问题,同时建立个体化疾病特异性i PSCs来治疗遗传性和退行性疾病可以避免免疫排斥的风险。一、目的建立羊水细胞来源、无外源基因整合的血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征患儿特异性诱导多能干细胞,为基因治疗研究及实现个性化宫内治疗提供模型。二、方法1、获得知情同意后,胎儿被诊断为血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征(--SEA/--SEA)的孕妇于孕16+周在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心行超声引导下的羊膜腔穿刺术,抽取10毫升羊水用于本研究。2、利用非整合型仙台病毒介导Klf4、Oct3/4、Sox2及c-Myc 4种转录因子将血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征胎儿的羊水细胞重编程为诱导多能干细胞。标记为h-AF-Se V-i PSCs。3、通过碱性磷酸酶试验,免疫荧光标记等对h-AF-Se V-i PSCs进行多能性鉴定。通过拟胚体形成和自发分化实验、畸胎瘤形成实验对h-AF-Se V-i PSCs在体外及体内向3个胚层细胞分化的能力进行鉴定。4、将h-AF-Se V-i PSCs第10代及第20代的细胞进行G显带染色体核型分析,检测细胞经重编程及传代培养后遗传物质的稳定性。将h-AF-Se V-i PSCs及原代羊水细胞提取DNA,进行缺失型α-地贫基因检测,对突变基因型进行验证,同时排除细胞污染。5、6×104个仙台病毒转导后的羊水细胞接种在饲养层细胞上,观察出现克隆的时间,并计算ES样克隆(碱性磷酸酶染色阳性)的个数。三、结果1、成功将血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征胎儿的羊水细胞利用仙台病毒重编程为非整合型诱导性多能干细胞(h-AF-Se V-i PSCs)。2、h-AF-Se V-i PSCs碱性磷酸酶染色(AP)强阳性。免疫荧光染色提示h-AF-Se Vi PSCs表达胚胎干细胞特异性蛋白Oct4、Sox2、SSEA-4和Tra-1-81。3、将h-AF-Se V-i PSCs注射到7周龄SPF级NOD/SCID雄性小鼠腹股沟皮下,i PS细胞注射10周后摘除肿块,并进行固定、包埋、切片、HE染色及免疫组化染色,HE染色和免疫组化染色结果均提示畸胎瘤内含有内胚层、中胚层及外胚层组织。h-AF-Se V-i PSCs悬浮培养后可形成囊性拟胚体,贴壁培养后同样能向三个胚层分化。4、h-AF-Se V-i PSCs第10代及第20代的细胞G显带染色体核型分析提示均为正常核型(46,XY)。h-AF-Se V-i PSCs及其原代羊水细胞提DNA行Gap-PCR检查提示其地中海贫血基因型均为--SEA/--SEA。5、仙台病毒转导后第4天,羊水细胞中出现胚胎干细胞样的克隆。转导后第7天,将羊水细胞接种到饲养层细胞上,转导后第9天,可见克隆样生长的细胞。共出现ES样克隆30个,碱性磷酸酶染色均阳性,其转导效率大约为0.05%。四、结论1、血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征胎儿的羊水细胞在体外可被仙台病毒诱导为无外源基因整合的i PSCs。2、h-AF-Se V-i PSCs具有自我更新和向三个胚层分化的能力,且羊水细胞经过重编程及在体外长期传代培养仍能维持其遗传物质的稳定,因此,h-AF-Se V-i PSCs可作为研究血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征宫内治疗的理想细胞模型。3、羊水细胞可作为是i PSCs的理想细胞来源。