目的:通过HCMV(human cytomegalovirus)AD169突变株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞,并对其UL55、UL74和UL75基因进行变异分析,研究其在病毒跨种属感染中的可能作用,为探索HCMV跨种属感染机制提供线索。　　方法:将本实验室HCMV AD169突变株和HCMV临床分离株复苏增殖后采用TCID50法滴定病毒感染剂量。以100 TCID50的剂量接种至BALB/c小鼠胚胎成纤维细胞(MF)和人胚胎成纤维细胞(HF),逐日镜下观察并进行如下检测:(1)观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);待出现明显CPE后,采用PCR和RT-PCR法分别检测 HCMV特异性基因IE和UL83的复制和转录。(2)采用HCMV pp65蛋白特异性单克隆抗体直接免疫荧光检测细胞中HCMV pp65蛋白的表达。(3)在感染后第30min、1h、2h、4h、8h、24h、2d和第5d,分别收集细胞培养物,提取DNA,采用荧光定量PCR法检测病毒拷贝数验证HCMV增殖动力学。(4)在感染后第1d、3d和第5d,分别使用HCMV IE-1、MCP和gB单抗进行间接免疫荧光检测,以进一步确定HCMV增殖状态。(5)对HCMV AD169突变株和临床分离株提取DNA进行 UL55、UL74和 UL75基因全长的PCR扩增并测序,将得到的序列与疱疹病毒科的其他代表毒株以及小鼠巨细胞病毒(MCMV)进行比对,经MEGA5.0软件分析绘制系统发育树。　　结果:以100 TCID50的剂量将HCMV AD169突变株和临床分离株分别接种至MF细胞和HF细胞后结果如下:(1)可观察到HCMV AD169突变株接种MF细胞出现病毒所致CPE,与HF细胞上的CPE相似,表现为细胞肿胀变圆,胞内颗粒增多,折光性增强。将培养物连续传代三次,仍然可观察到明显CPE。细胞培养物经PCR、RT-PCR法检测HCMV UL83、IE基因及其转录产物均阳性。(2)经pp65直接免疫荧光染色,在MF和HF细胞胞浆内均可见苹果绿色阳性信号,病毒pp65蛋白可在感染的两种细胞中表达。HCMV临床分离株接种MF细胞不出现CPE,细胞培养物经PCR、RT-PCR法检测HCMV UL83、IE基因及其转录产物均阴性,在MF细胞胞浆内无苹果绿色阳性信号。接种HF细胞后出现CPE,表现为细胞肿胀变圆,胞内颗粒增多,折光性增强。细胞培养物经PCR、RT-PCR法检测HCMV UL83、IE基因及其转录产物均阳性。经pp65直接免疫荧光染色,在HF细胞胞浆内可见苹果绿色阳性信号。(3)采用荧光定量PCR法检测病毒拷贝数验证HCMV增殖动力学的结果显示,HF与MF细胞在接种HCMV AD169突变株后的6h内,病毒DNA拷贝数波动均上升;但在感染后6-8h,病毒DNA拷贝数大幅降低;在感染后8h-5d,病毒DNA拷贝数持续上升。比较HCMV AD169突变株在HF细胞、MF细胞上的病毒DNA拷贝数变化,可以发现HCMV AD169突变株在接种MF细胞后第30min,其病毒拷贝数为100.56±0.01copies/100ng·DNA,与接种 HF细胞后第30min(100.54±0.02copies/100ng·DNA)无显著差异,但在接种后第1h、2h、4h、6h、8h、16h、1d、2d和第5d,MF细胞上的病毒拷贝数均低于其在HF细胞上的拷贝数,且差异具有显著性(P<0.05)。HCMV临床分离株在接种HF细胞后各检测时间点,病毒DNA拷贝数与HCMV AD169突变株在HF细胞的病毒DNA拷贝数变化相似,除接种后第6h(101.35±0.11copies)和第1d(101.32±0.08copies)病毒DNA拷贝数低于HCMV AD169突变株在HF细胞上相应时间点的病毒DNA拷贝数(101.59±0.12copies和101.52±0.14copies)且差异显著外,其他各时间点病毒DNA拷贝数与HCMV AD169突变株相应时间点的病毒DNA拷贝数比较均无显著差异。HCMV临床分离株在接种MF细胞后第1h病毒DNA拷贝数出现显著下降,在此后的时间点内均未显著上升,除接种后第30min(100.55±0.02copies)病毒DNA拷贝数与HCMV AD169突变株在MF细胞(100.56±0.01copies)和HF细胞(100.54±0.02copies)上相应时间点的病毒 DNA拷贝数无显著差异外,其它各时间点均显著低于HCMV AD169突变株在MF细胞和HF细胞上相应时间点的病毒DNA拷贝数。HCMV AD169突变株在MF细胞增殖趋势与其在HF细胞上的增殖趋势相似,均呈上升趋势,但病毒在MF细胞上的增殖速率略低于其在HF细胞上的增殖速率;HCMV临床分离株在MF细胞上不增殖。(4)采用HCMV IE-1、MCP和gB单抗进行间接免疫荧光检测观察感染后不同时间点细胞感染状况的结果发现,HCMV AD169突变株在感染HF细胞后,第1天即可在感染细胞细胞核内检测到IE阳性信号,第3天IE阳性信号明显加强,第5天IE阳性信号略有减弱,而MCP阳性信号出现在第3天的感染细胞细胞核内,gB出现阳性信号出现在第3天的感染细胞胞浆内,随感染时间延长,第5天MCP、gB阳性信号进一步加强。与感染HF比较,HCMV AD169突变株感染MF细胞后,第1天视野中无任何阳性信号出现;第3天才在感染细胞细胞核内出现IE阳性信号和较弱的MCP阳性信号,胞浆内无gB阳性信号出现;随感染时间延长,第5天感染细胞细胞核内IE、MCP阳性信号明显加强,感染细胞胞浆内有弱gB阳性信号出现,除感染后第5天IE阳性信号强于HF细胞外,其他各时间点阳性信号均较HF细胞感染后弱。而HCMV临床分离株接种MF细胞后直到感染后第5天仍无任何阳性信号检出,HCMV临床分离株接种HF细胞后第5天,感染细胞细胞核内有明显IE、MCP阳性信号,感染细胞胞浆内有明显gB阳性信号。说明HCMV AD169突变株可感染MF细胞,且在感染细胞中有病毒蛋白表达,但病毒蛋白表达时间与感染HF细胞有所差异;提示HCMV临床分离株不能感染MF细胞。(5)HCMV AD169突变株UL55、UL74和UL75基因序列经Clustal W软件比对分析后发现: UL74、UL75基因及其编码氨基酸序列与Genebank公布的HCMV标准株相应序列的同源性为100％,UL55基因及其编码氨基酸序列的同源性在99%~100%之间。在本研究中,能够感染小鼠胚胎成纤维细胞的HCMV AD169突变株UL55基因的83094位点由G突变为A,83106位点由G突变为C,83114位点由C突变为A,83119位点由A突变为G,83281位点由A突变为G,导致第133位氨基酸发生了天冬酰胺到天冬氨酸的突变,第127位氨基酸由谷氨酰胺到组氨酸的突变,第125位氨基酸由甘氨酸到天冬氨酸的突变,第71位氨基酸由谷氨酸到天冬氨酸的突变。经MEGA5.0软件绘制系统进化树后发现:能够感染小鼠胚胎成纤维细胞的HCMV,其UL55基因在进化树上与宿主广泛的HSV-1一起处在另一独立的支群内。　　结论:　　(1)实验证实我室HCMV AD169突变株在体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞中呈增殖性感染。此为进一步开展HCMV跨种属研究奠定了基础。　　(2)通过对HCMV AD169突变株和临床分离株UL55、UL74和UL75基因全长测序比对分析后发现:能够感染小鼠胚胎成纤维细胞的HCMV AD169突变株UL55基因存在核苷酸突变,并导致编码的氨基酸突变。经进化关系分析后发现HCMV AD169突变株,其UL55基因在进化树上与宿主广泛的HSV-1一起处在另一独立的支群内,提示UL55突变可能与HCMV细胞嗜性改变有关。