黄曲霉(Aspergillus flavus)作为一种腐生丝状致病真菌,常见于发霉的粮食和豆类和坚果表面,其产生的次级代谢产物黄曲霉毒素(aflatoxins)对人类和动物的肝脏具有很强的致癌性能够导致其快速死亡。一些抗菌剂(伏立康唑)常用于治疗黄曲霉的感染。然而,最近研究表明黄曲霉对唑类药物产生耐药性从而导致临床治疗真菌感染的失败。因此,深层次地了解黄曲霉的死亡机制有助于新的杀菌药物研发。麝香草酚(Thymol),主要存在于唇形科百里香属植物中,是百里香属植物精油的主要成分。研究表明麝香草酚可以有效抑制细菌、霉菌和酵母的生长。本研究发现麝香草酚能够诱导黄曲霉孢子的裂解死亡,为了进一步探究其作用机理,本文深度研究了麝香草酚诱导黄曲霉孢子的死亡方式以及可能的作用靶标。主要研究结果如下:1.麝香草酚对黄曲霉的杀菌效应麝香草酚对黄曲霉表现出了高效的抑菌效应:当浓度大于80μg/ml几乎完全抑制黄曲霉孢子的生长。通过孢子活力分析发现麝香草酚处理导致超过99.9%的黄曲霉孢子死亡。扫描电镜结果显示麝香草酚能够导致黄曲霉孢子发生裂解。ROS和NO作为细胞内的信号分子,经常被报道与细胞的死亡相关。本研究发现高浓度的麝香草酚可以诱导黄曲霉孢子产生大量的ROS和NO,而且ROS和NO产生的抑制剂均可以显著降低麝香草酚的这种杀菌效应。ROS抑制剂还可以抑制NO产生。由此可见ROS可能通过诱导NO产生,参与麝香草酚对黄曲霉孢子的致死作用。2.麝香草酚导致黄曲霉孢子的死亡方式为细胞凋亡真核细胞的死亡方式包含多种,总的来讲包含细胞凋亡和细胞坏死。通过Hoechst33342和PI双染,我们采用流式细胞仪和荧光显微镜对麝香草酚处理后黄曲霉孢子的早期生理活动进行了观察。结果表明麝香草酚处理3h孢子就开始发生凋亡;并且随着时间延长凋亡比例显著增加,在处理6h后大部分孢子已处于凋亡状态。通过Tunnel染色发现麝香草酚处理9h后黄曲霉孢子出现了凋亡的另外一个特征:DNA断裂现象;通过JC-1荧光探针标记,我们发现麝香草酚处理导致线粒体的膜电位减弱,这说明线粒体膜可能受到了损伤。真核生物线粒体损伤会释放细胞色素c到细胞质中并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase),启动细胞凋亡通过caspase 9检测试剂盒,我们发现麝香草酚处理后黄曲霉孢子中caspase 9的活性急剧增加通过使用不可逆的Caspase广谱抑制剂氟甲基酮(Z-VAD-FMK)抑制Caspase的活性,发现caspase 9的活性受到显著抑制,而且发生细胞凋亡的孢子数量明显减少。这就进一步表明麝香草酚可能诱导黄曲霉孢子线粒体损伤最终导致了凋亡发生。3.电压门控钾离子通道参与孢子凋亡为了进一步探索麝香草酚诱导黄曲霉孢子细胞凋亡的潜在靶标,我们在人体蛋白-药物互作数据库DRAR-CPI中检索能够与麝香草酚进行分子互作的蛋白。从中发现人体中电压门控钾离子通道蛋白(PDB id:1ZSX)可以与麝香草酚诱互作,而且与黄曲霉中的KCNAB具有较高的同源性。电压门控钾离子通道蛋白经常被报道与细胞凋亡的启动有关。随后我们通过同源建模构建了KCNAB的三级结构,并通过模拟分子对接发现麝香草酚与黄曲霉的KCNAB的互作,发现其作用方式跟其与人体1ZSX中的作用方式类似。通过K+荧光探针PBFI标记,我们发现麝香草酚处理导致孢子内钾离子浓度瞬间升高;当外源添加电压门控钾离子通道抑制剂(4-氨基吡啶)时可以抑制钾离子浓度的增高,而且同时显著降低了凋亡的孢子数量。这些结果有力支持了生物信息学的预测结果:麝香草酚可以与KCNAB互作,其结果促进黄曲霉孢子细胞凋亡。4.黄曲霉KCNAB的敲除体的构建鉴于KCNAB在麝香草酚诱导黄曲霉孢子细胞凋亡中的作用,我们研究了KCNAB在黄曲霉的一些生理功能。我们使用黄曲霉CA14Δpyr G ku70作为母本菌株构建了缺失突变体ΔKCNAB。结果显示KCNAB缺失导致黄曲霉孢子萌发紊乱:在蒸馏水中萌发而在培养中萌发受阻。进一步研究发现缺失突变体对洋葱表皮和花生的侵染力显著降低。这很可能是由于KCNAB作为电压门控钾离子通道β亚基其缺失会导致通道对外界刺激过度反应。使用麝香草酚处理突变体,发现突变体的K+激发现象更加明显,而且凋亡现象更加显著。这不仅证实了我们关于通道过度反应的猜想,而且进一步支持了电压门控钾离子通道蛋白参与了麝香草酚导致黄曲霉孢子细胞凋亡。通过上述试验,我们的研究表明麝香草酚处理首先导致钾离子的爆发,进而引起了线粒体损伤、ROS的产生、Caspase的激活,最终导致孢子发生细胞凋亡。研究结果证明电压门控钾离子通道蛋白β亚基可以作为靶标,应用于抗黄曲霉感染新药开发和抗黄曲霉毒素污染控制的策略制定。