论文部分内容阅读
反式-4-羟基-L-脯氨酸是L-脯氨酸羟基化后的产物,在医药、化工、食品、美容等行业中应用广泛。将微生物体内L-脯氨酸的生物合成途径与脯氨酸4-羟化酶催化的羟基化反应结合起来,在无外源L-脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,可以节约生产成本,充分利用微生物资源。首先,构建L-脯氨酸生物合成能力增强的重组大肠杆菌:通过全质粒PCR对克隆得到的pro BA中的pro B进行定点突变,突变的氨基酸位点是E143A、K145A;选择色氨酸串联启动子驱动突变基因的表达,构建得到重组质粒p ET28a-Ptrp2-pro BA2;发酵验证含有该重组质粒的重组大肠杆菌,摇瓶培养24 h测得L-脯氨酸的浓度可达1436mg/L,比原菌的L-脯氨酸积累量增加了约26倍。其次,构建无外源L-脯氨酸发酵生产反式-4-羟脯氨酸的共表达重组菌。在pro BA2、hyp基因共表达体系的构建中,选择这两个基因所在的载体p ET28a-Ptrp2-pro BA2、p UC19-Ptrp2-hyp作为共表达体系的依托,构建得到两个含有双基因的单质粒共表达体系和一个双质粒共表达体系,这两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化。在以葡萄糖为单一碳源、无外源L-脯氨酸存在的培养基中,培养含有三个不同表达体系的重组大肠杆菌,发现以p UC19质粒作为共表达载体时,反式-4-羟脯氨酸的浓度较高,摇瓶培养24 h达到98.9 mg/L,比原始菌株的反式-4-羟脯氨酸浓度提高了一倍。最后,优化无外源L-脯氨酸发酵生产反式-4-羟脯氨酸的重组大肠杆菌的培养基,采用单因素和正交实验得到最适摇瓶培养基成分为:Glucose 10 g/L,Tryptone 15 g/L,Fe SO4 3 mmol/L,Mg SO4 1 g/L,K2HPO4 3 g/L,Ca Cl2 0.015 g/L,培养基的初始p H为7.0。发酵验证优化后的培养基,重组菌培养24 h后测得反式-4-羟脯氨酸浓度达到222.7mg/L,比优化前提高了1.25倍。