【摘 要】
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CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的适应性免疫系统,II型CRISPR/Cas系统中的CRISPR/Cas9系统凭借操作简便、编辑高效等优势成为了当今最有效的基因组编辑工具之一。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是一种基因组比较小,但进化速率比较高的DNA病毒,会引起猪断奶后多系统衰竭综合征等其他猪圆环病毒相关疾病（Procine cir
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CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的适应性免疫系统,II型CRISPR/Cas系统中的CRISPR/Cas9系统凭借操作简便、编辑高效等优势成为了当今最有效的基因组编辑工具之一。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是一种基因组比较小,但进化速率比较高的DNA病毒,会引起猪断奶后多系统衰竭综合征等其他猪圆环病毒相关疾病（Procine circovirus associated disease,PCVAD）,严重影响养猪业的健康发展。因此,利用CRISPR/Cas9系统提高猪抗PCV2的能力对于畜牧业发展具有重大的意义。甘露糖受体C1基因（Mannose receptor C1,MRC1）是甘露糖受体家族的同名成员。课题组前期研究发现我国优良地方品种莱芜猪抗PCV2能力优于商品猪大长杂交猪,并且猪MRC1基因转录起始位点上游-864位点处存在14 bp的片段插入或缺失多态,插入该片段可以显著提高MRC1基因启动子区活性。不同猪品种间14 bp片段纯合子的基因型频率不同,其中大蒲莲猪和莱芜猪多于西方猪种,与猪抗PCV2感染有关。本研究利用CRISPR/Cas9系统将莱芜猪MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp插入到PK15细胞的MRC1启动子相同区域,以增加MRC1基因的表达量,进而抑制PCV2的复制;同时利用Cre-LoxP系统删除CRISPR/Cas9介导的基因编辑中筛选标记基因,以降低外源基因插入导致的生物安全风险。主要研究结果如下:（1）对Cre重组酶进行了诱导表达和纯化。通过SDS-PAGE分析发现,IPTG浓度为1.0 m M,37℃诱导9 h时,Cre重组酶表达量最多。对Cre重组酶纯化后,利用His标签单克隆抗体对其进行鉴定,Western Blotting结果表明纯化后的Cre重组酶会与该抗体发生特异性反应,并在38.5 k D处出现明显条带。（2）构建了p LV-LoxP-m Cherry-puro-LoxP载体并进行了验证。成功构建含有多克隆位点、嘌呤霉素抗性基因以及同向的LoxP序列的p LV-LoxP-m Cherry-puro-LoxP载体。将该载体进行慢病毒包装和浓缩,进而感染PK15细胞,用嘌呤霉素进行筛选得到了PK15-m Cherry细胞。用Cre重组酶和Cre质粒处理该细胞,验证Cre-LoxP系统的功能,流式细胞仪检测表明Cre重组酶效率明显低于Cre质粒,同时Cre质粒的表达效率为16.2%。（3）构建了MRC1同源重组载体和靶向载体。根据实验室前期研究的MRC1基因启动子差异序列设计同源臂,成功构建MRC1同源重组载体。以Lenti CRISPR v2载体为骨架,构建出靶向同源臂的6个靶向载体,并用T7E1酶测定靶向载体的打靶活性,发现sg RNA 3和sg RNA 4活性最高,分别为48%和49%。（4）利用CRISPR/Cas9系统向PK15细胞中敲入了MRC1基因转录起始位点上游的14 bp。将MRC1同源重组载体和靶向载体分别进行慢病毒包装进而感染PK15细胞,利用嘌呤霉素筛选得到了17组单克隆细胞,通过PCR鉴定发现三组MRC1基因编辑细胞,并用Cre质粒删除该细胞中的筛选标记基因。（5）鉴定了MRC1基因编辑细胞的抗病毒能力。对细胞接种PCV2病毒,与PK15细胞相比,MRC1基因编辑细胞中的MRC1蛋白表达量显著增高（P＜0.05）,同时ORF1病毒载量显著降低（P＜0.01）,表明MRC1基因启动子区插入14 bp片段后可以显著提高PK15细胞抑制PCV2复制的能力。综上所述,本研究成功诱导表达并纯化了Cre重组酶,构建了p LV-LoxP-m Cherry-puro-LoxP载体,利用纯化的Cre重组酶和Cre质粒验证了Cre-LoxP系统。将莱芜猪MRC1基因转录起始位点上游的14 bp敲入到了PK15细胞中,增加了MRC1蛋白表达量,降低了PCV2的复制,为后续抗PCV2基因编辑猪的生产奠定了基础。
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