EGCG通过microRNA-30b-5p/520e影响鼻咽癌细胞自噬的机制研究

来源 :广东医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuehungulei
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目的:  探讨 EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)能否通过调节microRNA-30b-5p/520e(微小RNA-30b-5p/520e)表达影响自噬启动基因BECN1表达活性,并调节鼻咽癌细胞的自噬水平。  方法:  1.构建BECN13’-UTR双萤光素酶报告基因野生型重组质粒psiCHECK-2-BECN1-WT及突变型重组质粒psiCHECK-2-BECN1-MUT,分别将野生型和突变型重组质粒与microRNA-30b-5p mimics、mimics negative control(mimics NC)、microRNA-30b-5p inhibitor、inhibitor negative control(INC)共转染293T细胞株,检测每组荧光素酶活性差异。  2.将鼻咽癌CNE2细胞瞬时转染microRNA-30b-5p mimics、mimics NC、microRNA-30b-5p inhibitor、INC后,分别用Real-time PCR检测细胞mircoRNA-30b-5p和BECN1-mRNA表达量变化;Western Blot法检测细胞中Beclin1蛋白表达水平。  3.分别将BECN13’-UTR双萤光素酶报告基因野生型重组质粒psiCHECK-2-BECN1-WT及突变型重组质粒psiCHECK-2-BECN1-MUT与microRNA-520e mimics、NC mimics、microRNA-520e inhibitor、inhibitor control共转染293T细胞株,检测每组荧光素酶活性差异。  4.将鼻咽癌CNE2细胞瞬时转染microRNA-520e mimics、mimics NC、microRNA-520e inhibitor、INC后,分别用Real-time PCR检测细胞mircoRNA-520e和BECN1-mRNA表达量变化;Western Blot法检测细胞中Beclin1蛋白表达水平。  5.0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL EGCG分别作用于鼻咽癌CNE2细胞24小时,CCK-8法测定细胞活力及半数抑制浓度;观察细胞的形态改变。  6.0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL浓度EGCG处理鼻咽癌CNE2 细胞24小时,用Real-time PCR法分别检测细胞中mircoRNA-30b-5p,mircoRNA-520e表达量变化,BECN1-mRNA表达量变化;Western Blot法检测细胞中Beclin1蛋白、LC3蛋白、p62蛋白表达水平;透射电子显微镜观察自噬小体形成情况。  结果:  1. psiCHECK-2-BECN1-WT与microRNA-30b-5p共转染293T细胞组的荧光素酶活性比psiCHECK-2-BECN1-WT与mimics NC共转染293T细胞组、psiCHE CK-2-BECN1-MUT与microRNA-30b-5p共转染293T细胞组的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。  2. psiCHECK-2-BECN1-WT与microRNA-520e共转染293T细胞组的荧光素酶活性比psiCHECK-2-BECN1-WT与mimics NC共转染293T细胞组、psiCHECK-2-BECN1-MUT与microRNA-520e共转染293T细胞组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。  3.转染microRNA-30b-5p mimics和转染mimics NC的鼻咽癌CNE2细胞比较,microRNA-30b-5p mimics组的表达水平明显升高(P<0.01),BECN1-mR NA表达水平显著降低(P<0.01),Beclin1蛋白表达量明显降低(P<0.05);而转染microRNA-30b-5p Inhibitor和转染INC的鼻咽癌CNE2细胞比较,microR NA-30b-5p Inhibitor组的表达水平明显降低(P<0.01),BECN1-mRNA表达水平明显升高(P<0.01),Beclin1蛋白表达量明显升高(P<0.05)。  4.转染microRNA-520e mimics和转染mimics NC的鼻咽癌CNE2细胞比较, microRNA-520e mimics组的表达水平明显升高(P<0.01),BECN1-mRNA表达水平显著降低(P<0.01),Beclin1蛋白表达量明显降低(P<0.05);而转染microRNA-520e Inhibitor和转染 INC的鼻咽癌CNE2细胞比较,microRNA-520e Inhibitor组的表达水平明显降低(P<0.01),BECN1-mRNA表达水平明显升高(P<0.01),Beclin1蛋白表达量升高(P<0.05)。  5.分别用(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL) EGCG作用于鼻咽癌CNE2细胞24小时,随着药物作用浓度的升高,细胞活性明显呈剂量依赖性降低(P<0.01);EGCG半数抑制浓度为92.86μg/mL。  6.0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL浓度EGCG处理鼻咽癌CNE2 细胞24小时,随着药物浓度的升高,microRNA-30b-5p、microRNA-520e表达明显降低(P<0.01),BECN1-mRNA表达明显升高(P<0.01),Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),LC3蛋白表达升高(P<0.05),p62蛋白表达降低(P<0.05);透射电子显微镜观察自噬小体数量增多(P<0.05)。  结论:  自噬启动基因BECN1是microRNA-30b-5p/520e的靶基因。EGCG能通过下调鼻咽癌 CNE2细胞中 microRNA-30b-5p/520e的表达,提高自噬启动基因BECN1的表达,从而促进自噬发生并抑制细胞增殖。
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