随着Edmonton方案的出台,胰岛移植已成为一种使1型糖尿病患者摆脱胰岛素依赖的安全有效的治疗方法,但该方案要求每个受者至少要接受2个以上供体的胰岛才能恢复血糖正常,这更加剧了供体短缺,胰岛来源有限已成为当前胰岛移植的主要障碍。异种胰岛有望改善胰岛匮乏的局面,但其面临强烈的反应,目前抑制排斥反应的常用方法就是大剂量的免疫抑制剂,但其为非特异性免疫抑制,有继发感染、肿瘤的危险。诱导抗原特异性耐受是器官移植中的理想策略,也是当前的研究热点。异种胰岛移植排斥反应主要由抗原识别“间接途径”激活的T淋巴细胞所介导。树突状细胞(dendritic cell, DC)是唯一能够激活初始T细胞反应的抗原递呈细胞,在激发免疫应答或在诱导免疫耐受中DC起着枢纽作用,其功能主要与其成熟状态有关。未成熟DC能有效提呈凋亡细胞抗原并转向成熟。近期研究显示,细胞因子信号抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)在抑制DC活化中起重要作用,因此,通过基因转染的方法上调SOCS1的表达能抑制DC成熟,维持其耐受原性。本研究中,我们用SOCS1基因修饰的受体DC负载供体凋亡脾细胞,然后于胰岛移植前7天注入受体,观察能否诱导T细胞耐受及延长异种胰岛移植物存活时间,本研究分以下七部分:第一部分小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建、鉴定目的:构建含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定。方法:以pEF-FLAG-1/mSOCS1质粒为模版,PCR扩增SOCS1序列,PCR产物经AgeI和NheI酶切,再定向插入到AgeI和NheI酶切的pDC316-LacZa质粒中,获得穿梭质粒pDC316-SOCS1,经PCR、AgeI和NheI酶切及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCS1与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。结果:PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109 IU/ml。结论:成功构建了含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础。第二部分小鼠骨髓源性树突状细胞体外培养及鉴定目的:建立一种简单经济的体外扩增、培养小鼠骨髓源性树突状细胞(bone marrow derived dendritic cell, BM-DC)的方法,并从形态学、免疫表型和细胞功能方面予以鉴定。方法:分离小鼠骨髓中DC前体细胞,用5ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)来扩增、培养小鼠BM-DC。培养体系分4天组和8天组组。培养第4天,收集疏松贴壁的细胞即为DC,用倒置显微镜、扫描电镜和透射电镜观察其形态特征,流式细胞仪分析其细胞表型,通过抗原吞噬实验和混合淋巴细胞反应(MLR)来观察其生物学功能。结果:培养所得的细胞具有典型的DC形态,4天组所得细胞其表型为、MHCⅡlow、CD40low、CD86low,具有很强的吞噬能力;而8天组所得细胞其表型为MHCⅡhigh、CD40high、CD86high,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论:用rmGM-CSF体外诱导培养可获得小鼠BM-DC。第三部分SOCS1基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响目的:研究SOCS1基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响。方法:用携带小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体转染小鼠DC,用免疫组化和Western blot检测DC中SOCS1的表达。用FCM检测DCs的细胞表型变化,通过混合淋巴细胞反应(MLR)观察DCs对T细胞增殖的影响,以ELISA检测细胞因子分泌水平,实验分为对照组、Ad-EGFP组、Ad-SOCS1组。结果:Ad-SOCS1组DCs中SOCS1表达明显,Ad-SOCS1组DCs中MHCⅡ分子及共刺激分子表达明显低于对照组及Ad-EGFP组;Ad-SOCS1组DCs IL-12的分泌与对照组DCs无显著差别,在LPS刺激时,Ad-SOCS1组IL-12的分泌均明显低于对照组DCs(P<0.05)。Ad-SOCS1组DCs对T细胞的增殖有抑制作用,而对照组及Ad-EGFP组DCs能明显激发T细胞增殖(P<0.05)。在MLR中,Ad-SOCS1组DCs明显抑制了Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌,而促进Th2类细胞因子IL-10的分泌(P<0.05)。结论:SOCS1基因转染能抑制DCs成熟,诱导T细胞向Th2方向分化,是制备耐受性DCs的有效方法。第四部分SOCS1基因转染小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后的免疫特性研究目的:研究SOCS1基因修饰的小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后的免疫特性。方法:用紫外线照射的方法来诱导大鼠脾细胞凋亡,FCM检测细胞凋亡。将大鼠凋亡脾细胞(Apo-SCs)与SOCS1基因转染的小鼠DC(SOCS1-DC)共培养48h,以使SOCS1-DC负载Apo-SCs(SOCS1-Apo-SCs DC)。FCM检测DC负载Apo-SCs前后共刺激分子的表达,通过初次MLR了解SOCS1-Apo-SCs DC刺激T细胞增殖的能力,用SOCS1-Apo-SCs DC预致敏小鼠后行再次MLR,观察SOCS1-Apo-SCs DC能否诱导抗原特异性T细胞低反应性。结果:小鼠DC可有效吞噬大鼠Apo-SCs,负载大鼠Apo-SCs的DC(Apo-SCs DC)其表面MHCⅡ分子及共刺激分子明显升高,刺激T淋巴细胞增殖的能力增强,而SOCS1-Apo-SCs DC其表面MHCⅡ分子及共刺激分子升高不明显,不能刺激T淋巴细胞增殖,再次MLR显示,SOCS1-Apo-SCs DC预处理的T细胞对与凋亡细胞同源的抗原产生低反应性。结论:SOCS1基因修饰的小鼠树突状细胞负载大鼠凋亡脾细胞后可诱导T细胞抗原特异性低反应性。第五部分大鼠胰岛的分离、纯化及鉴定目的:对大鼠胰岛分离、纯化条件进行优化,为下一步胰岛移植实验奠定基础。方法:通过胆总管逆行灌注胶原酶P溶液来消化大鼠胰腺,分离胰岛,采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛,观察胶原酶浓度、消化时间对大鼠胰岛分离结果的影响。双硫腙染色鉴定胰岛,丫啶橙/碘丙啶染色鉴定胰岛细胞活率,糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛功能。结果:胶原酶浓度、消化时间对胰岛分离结果有重要影响。1mg/ml胶原酶P在37℃静止消化45分钟条件下,胰岛分离效果最佳,效果较其他酶浓度和消化时间条件下好(P<0.05),在此条件下分离的胰岛其纯度超过90%,胰岛细胞活率接近90%,胰岛体外培养3天后在低糖(2.8mmol/L)、高糖(16.7mmol/L)刺激下胰岛素释放量分别为(0.67±0.14)μg/L/10islets,(5.44±0.09)μg/L/10islets,两组间有显著性差异(P<0.05),刺激指数为8.25±1.87。结论:胶原酶浓度、消化时间影响胰岛分离结果,优化分离条件可改善大鼠胰岛分离结果,1mg/ml胶原酶P静止消化45分钟条件下胰岛分离效果较好。第六部分糖尿病小鼠异种胰岛移植模型的建立和疗效观察目的:建立糖尿病小鼠模型及大鼠对小鼠异种胰岛移植模型,观察异种胰岛移植对小鼠糖尿病的疗效。方法:采用单次腹腔注射链脲霉素(200mg/kg)来制备糖尿病小鼠模型,以非空腹血糖连续超过16.7mmol/L视为造模成功。将600个大鼠胰岛移植到糖尿病小鼠肾被膜下,观察异种胰岛移植物的功能,以非空腹血糖连续超过11.2mmol/L视为移植物被排斥,功能丧失,并通过组织病理学观察异种胰岛移植物形态学的变化。结果:异种胰岛移植能使糖尿病小鼠血糖恢复正常,在无任何免疫抑制处理的情况下,异种胰岛移植物存活时间为6.50±1.05天,病理组织学检测证实,异种胰岛移植物被排斥。结论:成功建立糖尿病小鼠异种胰岛移植模型,为研究异种胰岛移植排斥或耐受奠定了基础。第七部分SOCS1基因修饰的受体树突状细胞负载供体凋亡细胞延长协调性异种胰岛移植物存活的实验研究目的:探讨负载供体凋亡脾细胞的受体耐受性树突状细胞在诱导协调性异种胰岛移植耐受中的作用。方法:建立Lewis大鼠对C57BL/6小鼠肾被膜下异种胰岛移植模型。胰岛移植前7天经尾静脉输注2×106个不同方法处理的受体DC来预处理受体小鼠,据输注DC的不同将实验分为6组:①对照组:单纯注射磷酸盐缓冲液;②DC组:单纯受体DC;③SOCS1-DC组:SOCS1基因转染的受体DC;④Apo-SCs DC组:负载供体凋亡脾细胞(Apo-SCs)的受体DC;⑤SOCS1-Apo-SCs DC组:负载供体Apo-SCs且已转染SOCS1基因的受体DC;⑥无关第三供体组:SD大鼠为供体,余处理同第5组。观察各组胰岛移植物存活时间及组织病理学改变,非空腹血糖低于11.2mmol/L视为血糖正常,血糖连续2天高于11.2mmol/L视为移植物排斥,功能丧失。结果:对照组、DC组、SOCS1-DC组、Apo-SCs DC组、SOCS1-Apo-SCs DC组及第三供体(SD)胰岛移植物存活时间分别为6.50±1.05天、6.14±1.57天、6.67±1.03天、4.86±1.35天、17.29±4.54天、6.17±1.17天,SOCS1-Apo-SCs DC组存活时间明显比其他各组长(P<0.01)。术后7天病理组织学检测发现,SOCS1-Apo-SCs DC组排斥反应明显较其他各组轻,该组移植物胰岛素染色明显较其他组强,提示移植物功能较好。结论:SOCS1基因修饰的受体DC负载供体凋亡脾细胞可延长协调性异种胰岛移植物存活时间。总结转染SOCS1基因能抑制DC成熟,SOCS1基因修饰的受体DC负载供体凋亡脾细胞可诱导T细胞抗原特异性低反应性,并能延长协调性异种胰岛移植物存活时间。