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软骨发育不全(Achondroplasia,ACH)是人类非致死性侏儒最常见的类型，主要影响四肢骨、椎骨等躯干骨的软骨内成骨过程，尤其是软骨形成过程。但其致病机制目前还不完全明确，尚无有效的治疗措施。成纤维细胞生长因子受体3(Fibroblast growthfactor receptors3, FGFR3)属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族成员之一，主要在生长板的静息、增殖及肥大前带表达，与骨骼发育及骨骼相关疾病有密切关系。绝大多数软骨发育不全（＞95%）由FGFR3功能增强点突变引起，FGFR3的功能增强点突变还可导致人类多种软骨发育障碍性侏儒，包括ACH、季肋发育不全(Hypochondroplasia, HCH)、致死性骨发育不全(Thanatophoric Dysplasia, TD)和严重软骨发育不良伴发育迟缓和黑棘皮症(Severe Achondroplasia with Developmental Delayand Acanthosis Nigricans，SADDAN)等骨骼异常疾病。利用FGFR3基因敲除和基因敲入小鼠模型所做实验结果均表明FGFR3是长骨软骨生成的负性调节分子。目前认为FGFR3主要通过STAT1-p21通路抑制软骨细胞的增殖，模拟人ACH的FGFR3功能增强型点突变小鼠模型(FGFR3G369C/+小鼠，即ACH小鼠)表现为个体变小，长骨生长板的形态结构紊乱，增生带短稀，软骨细胞增殖变慢。FGFR3同时通过ERK-MAPK通路抑制软骨细胞的分化，ACH小鼠表现肥大软骨细胞明显减少，肥大带变窄，伴Ⅹ型胶原（type Ⅹ collagen, ColⅩ）表达明显降低。也有研究认为FGFR3同时促进软骨细胞的终末分化，具体表现为FGFR3促进肥大软骨细胞提前进入终末分化阶段，上调软骨细胞终末分化标志基因如基质金属蛋白酶13（Matrix metalloproteinase13, MMP-13）、骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)的表达，导致生长板肥大带变窄，长骨生长受抑，但具体机制不明。目前已经针对FGFR3激活的STAT1-p21和ERK-MAPK通路进行干预，但不能完全缓解由于FGFR3功能增强所致的骨骼发育异常，提示可能存在其他未知的致病机制。软骨生成过程受多种信号通路的调节，包括FGFs/FGFRs、TGF-β、BMP、Wnt、Ihh/PTHrP等信号通路，软骨发育过程中，FGFR3功能增强点突变可能通过影响其他调控软骨发育的信号通路而导致侏儒表型。TGF-β信号在骨骼发育，尤其是软骨发育中发挥重要作用。在生长板发育过程中，TGF-β信号在软骨发育早期促进软骨发生，软骨发育早期缺失TGF-β信号导致小鼠出生后死亡并表现为肢体短小的类似侏儒的表型。但在软骨发育晚期，TGF-β抑制软骨终末分化，缺失TGF-β信号则加快软骨细胞终末分化和矿化。无论在软骨发育早期或晚期，FGFR3增强型点突变与TGF-β信号缺失所致动物或细胞表型非常类似，提示FGFR3与TGF-β信号通路之间可能存在交互作用（Crosstalk）。目前研究认为在配体水平，FGFs与TGF-βs通过激活下游信号通路存在信号交互作用，但在受体水平的研究较少。我们前期研究发现FGFR3与BMP受体BMPR1A（ALK3）在软骨细胞内存在直接相互作用，FGFR3促进Smurf1与ALK3的相互作用与泛素化降解，负性调节BMP信号通路。TGF-β与BMP两个亚家族同属于TGF-β超家族，TGF-β受体与BMP受体结构类似，并且TGF-β受体在生长板静息、增生、肥大前和肥大区均有表达，与FGFR3在静息、增生和肥大前区表达部位有重叠，提示在软骨发育过程中FGFR3与TGF-β受体可能存在类似相互作用，并参与调控TGF-β信号通路。以上证据均提示，在软骨发育及ACH发生过程中FGFs/FGFR3与TGF-βs信号通路可能存在交互作用，但在软骨发育的哪个阶段、具体作用方式和机制尚不清楚，有待进一步的研究。据此，我们利用细胞生物学、分子生物学等技术方法，研究FGFR3与TGF-β受体之间的相互作用及其机制，进一步利用体外细胞实验初步探讨FGFs/FGFR3与TGF-β信号通路交互作用在生长板软骨发育中的作用及意义。主要实验方法：1. FGFR3与TGF-β受体蛋白之间相互作用的研究采用免疫共沉淀、免疫荧光共定位等方法研究FGFR3与TGF-β受体蛋白之间的相互作用。1.1检测FGFR3与TGF-βRⅠ（ALK5）的相互作用。1.2检测不同FGFRs与ALK5的相互作用。1.3检测不同TGF-βs受体与FGFR3的相互作用。1.4检测不同激活形式的FGFR3与ALK5的相互作用。1.5检测FGFR3与ALK5相互作用的结构域。1.6检测ALK5与FGFR3相互作用的结构域。1.7检测生理条件下细胞内源相互作用。1.8激光共聚焦显微镜行免疫荧光染色检测FGFR3与ALK5细胞内的共定位。2. FGFR3对ALK5蛋白表达水平和TGF-β/TGF-βR介导的信号通路的影响293T细胞转染FGFR3及TGF-β通路相关质粒，利用Western Blotting和荧光素酶报告基因检测FGFR3对TGF-β/TGF-βR相关分子和下游信号通路的影响。2.1检测FGFR3与TGF-βR受体在蛋白水平的相互影响。2.2检测不同激活形式FGFR3对ALK5蛋白水平的影响。2.3检测FGFR3对ALK5蛋白半衰期的影响（通过加入蛋白翻译过程阻断剂CHX）。2.4检测FGFR3通过何种方式促进ALK5蛋白水平的降解（通过加入不同的蛋白降解途径阻断剂）。2.5检测FGFR3对TGF-β/TGF-βR介导的信号通路的影响。2.6分离ACH和FGFR3flox/flox; Col2α-CreERT小鼠原代软骨细胞，以同窝野生小鼠为对照，检测ALK5及磷酸化Smad2蛋白水平的变化。3. TGF-β1/ALK5对FGFR3激活所致软骨终末分化标志基因高表达的影响利用ACH原代软骨细胞和大鼠软骨肉瘤细胞（Rat chondrosarcoma, RCS），定量PCR检测TGF-β1/ALK5能否缓解FGFR3激活所致的软骨细胞终末分化标志基因的高表达水平。3.1分离ACH及同窝对照野生小鼠原代软骨细胞，给予ITS诱导7天至终末肥大分化后给予TGF-β1处理8h，提取RNA行定量PCR检测软骨终末分化标志基因MMP-13、OPN的表达。3.2RCS细胞内给予ALK5特异阻断剂SB-505124处理，提取RNA行定量PCR检测软骨终末分化标志基因MMP-13、OPN mRNA的表达。3.3RCS细胞内转染FGFR3-Y373C质粒和Ca-ALK5表达质粒，提取RNA行定量PCR检测软骨终末分化标志基因MMP-13、OPN mRNA的表达。主要实验结果1. FGFR3与TGF-β受体蛋白存在相互作用免疫共沉淀实验显示FGFR1、FGFR2、FGFR3与ALK5均有相互作用，并且ALK5和TGF-βRⅡ与FGFR3也存在相互作用。利用FGFR3不同激活形式突变体转染细胞，发现FGFR3与ALK5蛋白相互作用可不依赖于受体酪氨酸激酶活性。构建FGFR3和ALK5不同结构域突变体，确定了FGFR3的近膜区与ALK5存在相互作用，ALK5通过激酶区与FGFR3存在相互作用。另外在不同细胞系内我们发现FGFR3与ALK5存在内源相互作用。进一步免疫荧光染色确定FGFR3与ALK5在胞浆和胞膜均有广泛共定位。2. FGFR3对ALK5蛋白表达水平和TGF-β/TGF-βR介导的信号通路的影响Western Blotting实验显示FGFR3降低ALK5蛋白水平，但不影响TGF-βRⅡ蛋白水平，反之ALK5和TGF-βRⅡ蛋白不影响FGFR3蛋白表达水平。不同激活形式突变质粒都可以降低ALK5蛋白表达水平，提示FGFR3降低ALK5蛋白水平可能不依赖于FGFR3的受体酪氨酸激酶活性。定量PCR结果显示FGFR3不影响ALK5mRNA表达水平，加入蛋白翻译过程阻断剂CHX阻断蛋白合成观察蛋白降解，结果发现过表达FGFR3明显促进了ALK5蛋白降解速度。蛋白溶酶体降解途径的特异抑制剂氯喹处理可以明显缓解FGFR3对ALK5蛋白水平的降解作用，提示FGFR3促进ALK5蛋白溶酶体途径的降解。同时报告基因结果显示FGFR3抑制TGF-β1/TGF-βR介导的信号通路激活。分离原代软骨细胞行Western Blotting检测，结果提示FGFR3功能增强点突变小鼠（ACH小鼠）原代软骨细胞内ALK5及磷酸化Smad2蛋白水平相比同窝野生对照小鼠降低。经4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen, TM）处理诱导原代软骨细胞敲低FGFR3后，ALK5及磷酸化Smad2蛋白水平明显上调，进一步证明FGFR3通过降低ALK5蛋白水平负性调节TGF-β/TGF-βR信号通路。3. TGF-β1/ALK5对FGFR3激活所致软骨终末分化标志基因高表达的影响。定量PCR结果发现ACH小鼠原代软骨细胞内软骨终末分化标志基因MMP-13、OPN表达水平高于野生小鼠，给予TGF-β1处理可降低ACH小鼠软骨细胞MMP-13、OPN mRNA的表达水平。RCS细胞给予ALK5特异阻断剂SB-505124处理后明显上调MMP-13、OPN mRNA表达水平，同时细胞转染FGFR3-Y373C质粒导致MMP-13、OPN mRNA表达明显增高，提示MMP-13、OPN mRNA高表达与FGFR3降低ALK5蛋白水平有关，进一步表达ALK5可部分降低FGFR3高表达所致MMP-13、OPN mRNA高表达。主要结论：1. FGFR3通过近膜区与ALK5的激酶区结合，二者存在相互作用。2. FGFR3促进ALK5蛋白溶酶体途径降解，负性调节TGF-β/TGF-βR信号通路。3. TGF-β1/ALK5可降低FGFR3激活所致软骨终末分化标志基因MMP-13、OPNmRNA高表达水平。