外源甲醇/乙醇能够刺激植物生长己经得到反复证实,本实验室之前的研究对甲醇/乙醇刺激植物生长机理开展了大量工作,并提出了甲醇/乙醇刺激植物生长的信号介导机制,即认为甲醇/乙醇可能作为信号分子刺激光合相关基因的表达,进而增强植物的光合作用,促进植物的生长。油菜是仅次于大豆的重要食用油料作物,本研究以油菜为实验材料,首先分析不同浓度甲醇/乙醇对油菜生长和光合特性的影响确定最佳的喷施浓度；利用cDNA芯片技术鉴定油菜叶片中响应甲醇/乙醇刺激的差异表达基因并通过RT-PCR验证芯片数据的可靠性,分析甲醇/乙醇影响油菜光合特性可能的信号途径；通过分析外源H202.ABA的单独使用或与甲醇/乙醇共处理对油菜叶片光合速率和气孔生理生化特性的影响来阐明甲醇/乙醇是否通过调控H202的信号通路来影响油菜的气孔生理特性,进而增加光合速率；利用质膜H+-ATPase的抑制剂钒酸盐(VA)和腺苷-5’-单磷酸(AMP)单独处理或与甲醇/乙醇共处理油菜对油菜叶片光合速率和气孔生理生化特性的影响来揭示质膜H+-ATPase在油菜应答甲醇/乙醇刺激中的作用；利用质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白过量表达和抑制表达的转基因烟草验证质膜H+-ATPase的应答作用；最后通过分析Ca2+/CaM的抑制剂/拮抗剂单独使用或与甲醇和乙醇共处理对油菜气孔生理生化特性和CaM表达水平的影响来阐明CaM在油菜叶片响应甲醇和乙醇刺激中的作用。通过这些研究获得的结果来揭示甲醇/乙醇刺激油菜生长并促进其光合作用的分子机理,进一步挖掘甲醇/乙醇作为植物生长调节剂在农业生产上的应用潜力并为它们的推广应用提供理论依据,取得以下主要研究结果：1、分析不同浓度甲醇/乙醇对油菜生长的影响,结果表明甲醇/乙醇均刺激油菜生长,2%和5%甲醇的喷施使油菜叶片鲜重增加53%和145%；2%和5%乙醇使油菜叶片鲜重增加了107%和223%。5%的甲醇/乙醇对油菜生长和光合作用的刺激作用最大,乙醇的作用效果明显比甲醇好。甲醇/乙醇刺激也影响了油菜叶片和气孔的生理特性,5%甲醇喷施叶片使四个油菜品种叶片气孔导度分别增加25%、20%、23%和22%；5%乙醇喷施使这四个油菜品种叶片气孔导度分别提高32%、27%、31%和32%。5%甲醇/乙醇的喷施使油菜总叶绿素含量分别增加27.57%和32.06%。不同油菜品种响应甲醇/乙醇的刺激存在差异,综合生长及光合作用的各项指标,本研究选取油菜品种秦油二号为后续实验材料。此外,5%甲醇/乙醇喷施降低了油菜叶片内源H2O2含量,显著增加叶片三种抗氧化物酶(SOD、CAT、POD)的活性。从以上结果推测抗氧化物酶活性的增加可能是叶片内源过氧化氢减少的直接因素,而光合效率和气孔导度的增加可能与叶片H2O2含量减少有关。2、为了在转录水平上理解甲醇/乙醇刺激油菜生长并促进其光合作用的机理,利用cDNA芯片技术分析叶片喷施5%甲醇/乙醇油菜叶片的差异表达基因,结果说明响应甲醇/乙醇上调的基因数显著大于下调基因的数,其中甲醇上调和下调的基因数分别为294个和199个,乙醇上调和下调的基因数分别为358个和147个。RT-PCR分析结果证实3个钙调素相关基因在甲醇/乙醇喷施12h被诱导表达,光合作用相关的33个基因及2个14-3-3蛋白、1个质膜(PM)H+-ATPase相关基因的表达则在24-48h被甲醇/乙醇强烈诱导,这说明甲醇/乙醇刺激可能通过影响钙调素信号通路来调控光合作用相关基因的表达。Western blot和免疫共沉淀(CO-IP)分析表明,油菜叶片质膜H+-ATPase口14-3-3蛋白的的表达量和相互作用均随着甲醇/乙醇处理时间的增加而增强。这些结果说明质膜H+-ATPase与14-3-3的表达和相互作用也参与油菜对甲醇/乙醇刺激的应答。3、气孔是植物与外界环境进行气体交换的重要场所,气孔的生理生化特性和光合作用效率密切相关。H2O2是调控植物气孔运动的重要信号分子之一,分析外源H2O2的单独使用或与甲醇/乙醇共处理对油菜叶片光合速率和气孔生理生化特性的影响,结果表明随外施(涂抹叶片12h)H2O2浓度(10-10000μM)的增加,油菜光合速率和叶片气孔开度逐渐减小,叶片和保卫细胞内H2O2含量逐渐增加。用1mM的H2O2涂抹叶片1h之后再涂抹2mmM甲醇/乙醇11h,保卫细胞内H2O2含量显著降低,同时缓解了H2O2对油菜气孔开度、气孔传导率及光合作用的抑制。单独使用2mM甲醇/乙醇增加油菜叶片质膜H+-ATPase活性和质膜氢泵活性,而单独使用过氧化氢的结果与单独使用甲醇/乙醇相反。甲醇/乙醇与H2O2联合使用可缓解H2O2对叶片质膜H+-ATPase活性和质膜氢泵活性的抑制,但不能完全逆转外源H2O2造成的影响。CO-IP分析结果表明,甲醇/乙醇还能够缓解外施H2O2对质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白相互作用的抑制。这些结果表明甲醇/乙醇的应用可拮抗外源H2O2对油菜光合速率和气孔生理生化特性的抑制,由此推测甲醇/乙醇可能通过调控H2O2的信号通路来影响油菜的气孔生理生化特性,进而增加光合速率。4、H2O2是脱落酸(ABA)调控气孔运动信号途径的下游成员,为了解ABA是否参与甲醇/乙醇对H202信号通路的调控作用,分析单独用外源ABA处理或与甲醇/乙醇的共处理对油菜叶片光合速率和气孔生理生化特性的影响,结果表明单独用ABA涂抹叶片12h时,随着ABA浓度的升高(10-1000μM),油菜叶片光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度都呈现明显的下降趋势,同时叶片和气孔保卫细胞内H2O2含量上升,质膜H+-ATPase活性和质膜氢泵活性减少。用10μtM的ABA涂抹叶片1h之后再涂抹2mM甲醇/乙醇11h能显著缓解ABA对光合作用的抑制,同时使叶片内H202含量比单独的ABA处理时低51%和58%,保卫细胞内H202含量显著降低,叶片质膜H+-ATPase活性和氢泵活性增加29%和33%,但无法使其恢复到无处理对照的水平。CO-P分析表明甲醇/乙醇的存在能够显著减弱ABA对质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白结合的抑制作用。这些结果表明甲醇/乙醇也能拮抗ABA对油菜光合作用和孔生理生化特性的抑制,由此推测甲醇/乙醇可能还通过影响ABA的信号传递来降低内源H202的积累,进而增加质膜H+-ATPase活性和氢泵活性,促使气孔开放并增加气孔传导率和叶片的光合作用。5、质膜H+-ATPasee是调控气孔运动信号途径的关键成员和效应器,为确定质膜H+-ATPase在油菜叶片气孔生理特性响应甲醇/乙醇刺激中的作用,分析质膜H+-ATPase的抑制剂VA和AMP单独处理或与甲醇/乙醇共处理油菜对油菜叶片光合速率和气孔生理生化特性的影响。结果表明随着外源使用(涂抹叶片12h)VA(30-120μM)和AMP浓度(50-200μM)浓度的升高,油菜叶片光合效率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度逐渐下降,而叶片和保卫细胞中H2O2含量逐渐升高。90μM的VA或150μM的AMP涂抹叶片1h后再涂抹2mM甲醇/乙醇1Ih,明显缓解VA或AMP对叶片质膜H+-ATPase和氢泵活性的抑制,减少VA和AMP增加的H2O2含量,并明显缓解VA和AMP引起的气孔开度和气孔导度的下降程度,但对AMP处理组的改善效果不如VA处理组。根据Western blot和CO-IP分析结果推测甲醇/乙醇可能通过增强质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的表达和相互作用来拮抗VA和AMP的作用。6、本实验室郭传龙硕士论文制备了质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白过量表达(GHA5(?)S23)和抑制表达(RE1O和RP1)的四种转基因烟草,本论文利用这四种转基因烟草进一步验证上述推测。结果表明叶面使用(涂抹叶片12h)2mM甲醇/乙醇处理都增加四种转基因烟草叶片的光合效率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度,但对不同类型转基因烟草生长的刺激效果存在差异,对GHA5和S23的刺激效果好于RE10和RPl,而乙醇的作用效果又好于甲醇。甲醇/乙醇对四种转基因烟草质膜H+-ATPase活性和氢泵活性的刺激效果与它们对光合作用的刺激效果一致。Western blot和CO-IP分析结果证实甲醇/乙醇的使用对GHA5和S23叶片中质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的表达及相互作用的增强效果大于RE10和RP1。7、为了解钙调素在甲醇和乙醇调控油菜气孔生理特性中的作用,用Ca2+/CaM抑制剂三氟派嗪(TFP)、钙通道抑制剂硝本地平(NIF)和非特异性蛋白酶抑制剂星形孢菌素(ST)和钙调素信号拮抗剂(W7/KN62)的单独处理或与甲醇和乙醇共处理油菜叶片,分析气孔生理生化特性和CaM表达水平的变化。结果表明5种不同抑制剂/拮抗剂处理(涂抹叶片12h)都抑制油菜的光合作用并减少气孔开度和气孔导度,造成叶片三种抗氧化酶活性降低和过氧化氢在叶片中的积累,降低CaM的表达水平。分别用这5种抑制剂/拮抗剂涂抹叶片1h后再涂抹2mM甲醇/乙醇11h,结果发现都改善它们对光合作用、气孔开度及气孔导度的抑制效应,其中缓解程度最大的是KN62造成的抑制,其次是W7和ST造成的抑制,而对NIF和TFP造成的抑制作用改善效果较小。与此同时CaM的表达水平提高,三种抗氧化酶活性增强,叶片中过氧化氢含量降低。由这些结果可推测甲醇/乙醇可能通过提高CaM的表达水平并增强Ca2+/CaM信号通路的作用来影响抗氧化酶的活性,进而拮抗Ca2+/CaM的抑制剂或拮抗剂对油菜叶片气孔生理特性的影响效果。