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[研究背景]流行病学资料揭示,支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管肺恶性肿瘤、间质性肺疾病等呼吸系统疾病的发病率逐年升高,并与空气污染密切相关,研究发现,长期暴露于空气污染物中,亦将导致肺功能减退。短期内高浓度空气细颗粒物的暴露导致急诊就医和住院率上升,医疗资源需求压力陡增。2018年版慢性阻塞性肺疾病全球倡议中,新增空气污染颗粒暴露将影响COPD疾病进展的因素等内容。此GOLD指南内容的更新,警示在全世界范围内严控空气细颗粒物污染的必要性。空气污染物中,PM2.5(动力学直径小于2.5um的大气颗粒物)因其粒径小、在空气中滞留时间长、有特定的沉积特性,通过呼吸作用进入人体后,极易运输和沉积到细支气管和肺泡表面,干扰肺内气体交换,致病呼吸系统疾病。气道上皮细胞作为肺组织接触外界环境的第一关卡,是PM2.5的首要作用靶点,针对PM2.5的致病性研究,相关体内、外实验揭示其致病机制主要是氧化应激作用,可致抗氧化基因损伤,继发炎性反应,气道不可逆损伤及相关疾病的发生发展。PM2.5与支气管哮喘的相关性已得到流行病学资料的支持,但具体机制尚不明确。[研究目的]气道上皮细胞是呼吸系统的第一屏障,也是PM2.5作用的重要靶点,PM2.5是否经气道上皮细胞损伤途径诱导气道上皮气道炎症产生,从而导致支气管哮喘的发生与发展?本研究建立PM2.5作用于气道上皮细胞的体外培养体系(普通培养体系和transwell培养板模拟正常气道气体接触体系),围绕气道上皮的存活、Th2型细胞因子和阴离子电流产生,进行PM2.5对气道上皮细胞损伤及功能的研究。[研究目标]1、PM2.5作用气道上皮细胞,是否对气道上皮细胞存活存在影响?2、PM2.5作用气道上皮细胞,是否诱导Th2型细胞因子分泌,从而导致哮喘相关气道炎症发生?3、PM2.5作用气道上皮细胞,是否改变阴离子电流的产生而破坏气道上皮细胞的气道屏障功能?[研究内容和方法]1、PM2.5收集及其混悬液制备:于2017年11月期间在广州市主干道边-中国科学院广州地球化学研究所,采用大流量大气采样器,使用纤维滤膜收集PM2.5;PM2.5混悬液的制备:将载有颗粒物的纤维滤膜超声震荡洗脱,离心,冻干制成PM2.5冻干粉。2、研究对象:由中山大学提供的人气道上皮细胞株(calu-3,P53),不同作用条件分组刺激气道上皮细胞,模拟体内PM2.5经呼吸道进入体内,作用于气道上皮细胞的过程。第一部分PM2.5对气道上皮细胞存活的影响1、实验方法:1).设立空白对照组、不同浓度PM2.5组(50、100、200ug/uL)、PAH(苯并芘)组、OVA组、OVA+PM2.5组;2).设立作用时间组24h,48h,72h;3).光镜观察细胞存活状态,MTT法检测各分组细胞相对存活率;4).统计学分析各组间差异。2、实验结果:1)、光镜下观察到PM2.5作用气道上皮细胞可致细胞死亡,浓度效应明显,浓度越高细胞悬浮率越高,且与作用时间相关,作用时间越长,细胞存活率低。2)、MTT法检测细胞相对存活率:PM2.5作用气道上皮细胞可影响细胞的相对存活率,浓度越高效应明显,且与作用时间相关,24h组细胞存活率高于48h组及72h组,48组不高于72h组。3、结论:1).光镜观察与MTT法检测,PM2.5能影响气道上皮细胞存活率,其抑制细胞存活作用与PM2.5浓度及作用时间相关。2).细胞存活率直接反映细胞增殖抑制率和细胞毒理作用,PM2.5暴露将对体外培养的气道上皮细胞产生毒性作用,能抑制气道上皮细胞增殖,其作用效果与PM2.5浓度和作用时间相关。第二部分.PM2.5对气道上皮细胞对Th2型细胞因子产生的影响1、研究方法:1).设立空白对照组、PM2.5组、OVA对照组、OVA+PM2.5组;2).设立作用时间组24h,48h,72h;3).收集细胞及培养上清,RT-PCR及ELISA方法检测TSLP、IL-33、Eotaxin-3、E-钙粘蛋白mRNA及蛋白表达;4).统计学分析各组间差异。2、实验结果:1)、RT-PCR方法:PM2.5作用气道上皮细胞,检测TSLP,Eotaxin-3 mRNA表达水平较空白对照组显著增高(P<0.05)。PM2.5作用气道上皮细胞,检测IL-33、E-钙粘蛋白mRNA表达水平低下,数值无统计学意义(P>0.05)。2)、ELISA检测:PM2.5作用气道上皮细胞,IL-33,TSLP,Eotaxin-3蛋白水平表达浓度组间及时间组间均无组间差异(P>0.05)。3、结论:PM2.5作用气道上皮细胞,其培养上清中Th2型细胞因子(TSLP、Eotaxin-3)mRNA表达水平上升,但蛋白表达水平无明显升高,PM2.5存在致Th2型细胞因子水平分泌增多,诱导气道上皮细胞Th2型细胞因子为主的气道炎症以及发支气管哮“喘发生发展的病理生理基础的可能。第三部分PM2.5对气道上皮细胞导致气道屏障功能受损1、实验材料及对象同前;使用transwell培养板模拟正常气道气体接触培养环境。2、研究方法:1).设立空白对照组、PM2.5组、PM25+FSK(腺苷酸环化酶激动剂)组、FSK组;2).短路电流法检测阴离子电流;3).统计学分析各组间差异。3、研究结果:PM2.5组作用气道上皮细胞电流短路法检测阴离子电流明显抑制;FSK+PM2.5组气道上皮细胞电流短路法检测阴离子电流明显抑制。4、结论:PM2.5抑制气道上皮细胞CFTR介导的阴离子电流的产生和表层液体的分泌。