脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗是临床医学的世界性难题，约占全身创伤的0.2-0.5%。据不完全统计，我国SCI人数已突破百万。每年以12万的速度剧增。随着干细胞用于脊髓损伤实验研究的深入，其在脊髓损伤修复方面取得了一定进展。但是与脑内神经干细胞不同，神经干细胞分化为神经元细胞的效率较低。脊髓神经干细胞（NSCs）很难向有重要功能意义的神经元细胞分化，这一直是神经干细胞研究的难点。近年，神经干细胞迁移分化调控的微环境研究，逐渐成为研究的热点。研究发现不是因为脊髓源NSCs缺乏向神经元细胞分化的潜能，而是微环境不同造成的。多种生物手段，通过改变脊髓NSCs的内外环境促进其向神经元分化，但是这些手段要么收效甚微，要么危害较大，有诱发肿瘤的可能。因此需要新的更安全方便的手段。人类使用电流治疗疾病已有很久的历史了，以往对用电流应用于疾病治疗，大都是经验性的，这给患者造成了极大的伤害。随着科技的进步，对人体生物电现象的研究逐步深入。现已发现生物体中广泛存在生物电现象，这种效应广泛涉及胚胎的发育以及损伤后的组织修复过程等。已经证实发育过程中神经细胞迁徙增殖，甚至肿瘤细胞的转移都与之有密切的关系。应用外加电刺激可以促进神经损伤的修复。已有体内研究发现，电流刺激神经传导束可以引起中枢神经系统内源性的神经干细胞/神经前提细胞的增殖迁移分化。但是这种外加电流刺激与生物体内的自然生物电流场效应有很大差别，内源性的电流场效应主要是由于体内带电粒子在细胞及组织和器官内外的分布不均导致的。这种内源性生物电效应参与神经干细胞活化调控的微环境研究，逐渐成为生物物理学研究的热点。因此，生物电流场的研究近年来来逐渐受到国内外学者的重视，其研究意义重大。本研究根据我们前期在生物性神经微电极修复神经损伤研究方面取得的经验，我们将模拟体内的内生电场特点，在体外构建仿生弱电流场细胞培养体系，最大程度地模拟体内环境、充分考虑电流场这一生物物理因素的特点，观察弱电流场对脊髓源NSCs增殖分化作用的特点，进而为干细胞治疗脊髓神经损伤提供理论依据和新的治疗策略。具体内容如下：第一部分脊髓源NSCs分离、培养及鉴定目的：无血清悬浮分离培养法，从胎鼠脊髓分离NSCs。采用形态学、免疫荧光技术和多向分化进行神经干细胞鉴定。方法：应用悬浮培养分离培养法，培养纯化E13.5d C57胎鼠的脊髓源NSCs。倒置显微镜观察细胞形态学变化；CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达；使用自然分化法验证P4代脊髓源性NSCs多向分化特性，明确其分化能力。结果：无血清悬浮分离培养法，可以顺利获取脊髓源性NSCs。细胞增殖能力检测发现，培养的脊髓源性NSCs增殖活性良好。利用免疫荧光技术检测到脊髓源性NSCs高表达Nestin和Sox2。对荧光检测图像结果融合后，发现上述两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合，说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示，细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化，证明脊髓源性NSCs分化潜能较好。结论：无血清悬浮培养方法，可以成功培养获取NSCs。经过增殖活性、免疫学及凋亡检测，表明细胞活力较强，多分化潜能旺盛。第二部分仿生弱电场微环境中脊髓源NSCs增殖分化特点目的：在仿生弱电场环境中连续培养脊髓源NSCs，探索其增殖分化的具体条件。初步阐明仿生弱电流场刺激对脊髓源NSCs增殖分化为神经元细胞的作用。为生物物理技术应用于脊髓重建修复提供实验依据。方法：（1）在活细胞工作站中构建仿生弱电流场活细胞小室，电流强度（A:20mV/mm、B:60mV/mm、C:100mV/mm、D:140mV/mm、E:空白对照）和液面高度（A:1.5＃x2400um、B:1.5＃x4800um、C：1.5＃x61200um、D:1.5＃x81600um、E:正常液高（2500um））。对NSCs进行干预后，CCK-8法、流式细胞技术检测各处理组细胞增殖能力和凋亡比率，获得弱电场微环境条件。（2)根据获得的仿生弱电流场微环境条件，进行脊髓源NSCs增殖分化研究。分别设立弱电场组，自然分化对照组；GFAP和Tuj1免疫荧光染色鉴定细胞分化情况，根据Tuj1阳性数与DAPI核染数相比得出阳性率，比较两组间神经元分化是否有差异。结果：（1）弱电流场实验结果表明，条件参数设定为60mv/mm,800um时细胞活力最强，凋亡率最低。从各个时间点检测结果显示，B组细胞形态及数量均明显优于其余各组；细胞增殖能力较其余各组明显提高，且差异具有统计学意义。细胞凋亡检测发现该条件的弱电流场能够减少细胞凋亡。从而确定了60mv/mm和液面高度为800um为适宜电刺激微环境参数。（2）根据上述实验结果，在细胞培养小室中，应用常规自然培养作为对照，通过神经细胞表面标记物荧光染色结果的比较，发现仿生弱电场微环境组NSCs分化为神经元数量较对照组，统计学有显著差异（p<0.05）。结论:实验证明，确定60mv/mm和液面高度为800um，为适宜电场微环境参数，应用于NSCs诱导分化为神经元细胞实验，研究结果表明，仿生弱电场能够促进脊髓源NSCs的增殖，并且还能促进脊髓源NSCs向神经元分化。由于电流不同于生物手段，作为一种生物物理因素其可以明显提高神经干细胞的增殖，并促进其向神经元分化。本实验为应用仿生弱电场干预干细胞提供实验依据，为干细胞治疗脊髓神经损伤提供理论依据和新的治疗策略。