研究背景精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,Spag9）也被称作c-Jun氨基末端激酶相关亮氨酸拉链蛋白（c-Jun NH2-terminal kinase-associated leucine zipper protein,JLP）,是c-Jun氨基末端激酶信号通路相关蛋白（c-Jun NH2-terminal kinase-associated interacting proteins,JIPs）家族成员之一。编码JLP的基因Spag9基因位于人类17号染色体（17q21.33）~1,可选择性剪接出3种蛋白——JLP（3921bp;1307个氨基酸）、JIP4（3426 bp;1142个氨基酸）和SPAG9（2268 bp;766个氨基酸）~2。JLP为JNK和p38MAPK信号通路中的1个支架蛋白,由Reddy小组于2002年首次发现~3。JLP富含脯氨酸,其蛋白结构为:N端（M2）由2个亮氨酸拉链结构域构成,其C端表达线虫同源蛋白,目前功能未明~4。支架蛋白作为信号分子的聚合平台,通过结合募集、定向投递及效应反馈信号分子,在信号转导通路的活化中发挥着重要作用5-7。前期关于JLP的研究集中在神经细胞、肿瘤中,一系列研究报道了JLP在神经细胞中的对细胞胞膜和胞质的囊泡转运重要调控作用。2016年,王惠明课题组首次发现支架蛋白JLP存在于肾脏肾小管上皮细胞中,在肾小球及肾间质中几乎无表达;随后本课题组使用JLP全身敲除小鼠构建肾脏纤维化模型,发现JLP在肾脏纤维化进程中通过拮抗EMT进程发挥肾脏保护作用8,9,进而确定支架蛋白JLP为重要的肾脏内源性抗纤维化分子。而在肿瘤细胞中,JLP则有促进EMT的作用。关于JLP这两种不同表现无更进一步研究。研究目的为了进一步了解JLP在肾脏疾病中的作用和分子机制,我们有必要构建JLP蛋白肾脏缺失小鼠模型。研究方法构建mSpag9基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞（ES细胞）,将筛选出的阳性ES细胞克隆,经显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代筛选嵌合体小鼠,与携带FLP位点C57BL/6小鼠杂交后得到mSpag9flox/+基因敲除小鼠,自交筛选出mSpag9flox/flox小鼠再与肾脏中特异性表达Cre重组酶的KSP-Cre小鼠杂交得到mSpag9flox/flox-Cre+肾脏特异性基因敲除小鼠。随后利用免疫印迹、免疫荧光检测支架蛋白JLP在小鼠体内各器官组织的表达水平并评估mSpag9flox/flox-Cre小鼠生长发育、繁殖能力是否与野生型小鼠存在差异。实验结果经PCR扫描后得到10株阳性ES细胞克隆,使用Southern Blot鉴定其中6株;经显微注射后得到Chimera小鼠,与FLP小鼠杂交后得到9只mSpag9flox/+基因敲除小鼠,将扩增繁殖后得到的杂合子小鼠自交,得到的mSpag9flox/flox小鼠;将mSpag9flox/flox小鼠与在KSP-Cre小鼠交配筛选出3只mSpag9flox/+-Cre+小鼠,将其与mSpag9flox/flox小鼠回交得到基因型为mSpag9flox/flox-Cre+小鼠,即为基因水平上mSpag9基因肾脏特异性敲除小鼠。利用免疫印迹免疫荧光检测该基因小鼠体内组织器官包括脑、脾脏、睾丸、心脏、肺、肾脏,检测结果显示,mSpag9flox/flox-Cre小鼠肾脏组织中支架蛋白JLP的表达水平较脑、脾脏、睾丸、心脏、肺等均下降;与野生型小鼠肾脏中支架蛋白JLP的表达量相比具有明显差异。与野生型小鼠相比,mSpag9基因肾脏特异性敲除小鼠的生长发育、生育能力不受基因敲除影响。结论该模型利用Cre-Loxp系统实现基因mSpag9的基因打靶,为进一步研究mSpag9基因及支架蛋白在肾脏生理病理进展中所发挥的作用提供工具。