芹菜素(apigenin)又称为洋芹素、芹黄素,是一种天然存在的植物黄酮类化合物。芹菜素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等多种生理学活性,在医药和保健品领域具有广阔的应用前景,需求量逐年增加。采用传统的植物提取法需要消耗大量的有机试剂和植物原材料,而且分离纯化步骤繁多,产率较低;化学合成法的反应条件苛刻,副产物较多。在体外利用酶促反应合成芹菜素的方法简单、环保、反应条件温和,可弥补前两种方法的缺点,因此,具有很好的发展和应用前景。本文旨在建立一种体外酶法合成黄酮类化合物芹菜素的新方法,以替代传统的提取法和化学合成法。首先,本研究参照植物体内黄酮类化合物合成的途径,设计了一条体外通过酶促反应合成芹菜素的途径,该途径包括四种关键酶,依次是4-香豆酰辅酶A连接酶1(4CL1)、查尔酮合酶2(CHS2)、查尔酮异构酶(CHI)和黄酮合酶I(FNSI)。本文从黄豆的根和叶子中分别克隆出CHI(gm)、4CL1(gm)基因,从高粱和芹菜叶子中分别克隆出CHS2(sb)和FNSI(ag)基因。先在大肠杆菌体内鉴定了这四种关键酶的活性,结果表明:在发酵液中检测到相应黄酮类化合物的存在,说明这四种关键酶的基因能够在大肠杆菌体内进行功能性表达。将编码这4个酶的基因构建到原核表达载体pET-32a上,并将测序正确的重组质粒分别转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达蛋白,利用镍柱对可溶性表达的重组蛋白进行纯化。SDS-PAGE电泳结果显示,各融合蛋白的纯度达到了 90%左右。然后,利用纯化后的融合蛋白酶与相应底物在体外进行酶促反应以合成芹菜素,并通过聚酰胺薄层色谱、液质联用仪鉴定所合成的产物。结果表明,纯化的4CL1(gm)、CHS2(sb)、CHI(gm)、FNSI(ag)重组蛋白在体外都具有生物学活性,能够将各自对应的底物催化生成产物,最终合成芹菜素。最后,为了提高反应产量,进行了酶促反应条件的优化。逐一优化反应体系的成分、pH值、温度、时间、底物浓度等条件,确定了 4种融合蛋白各20 μg/mL时,相对适宜的反应条件为 200 mM Tris-HCl(pH 7.2),10%甘油,5 mM MgCl2,5 mM 抗坏血酸,5 mM ATP,300μM辅酶A,280μM丙二酰辅酶A,300μM4-香豆酸,0.1mg/mL牛血清白蛋白,0.25 mM α-酮戊二酸,0.1mM亚铁离子;反应温度为28℃;反应时间为2h。综上所述,本文建立了一种体外利用酶促反应合成芹菜素的新方法,并进行了反应条件的初步优化,为芹菜素的工业化生产提供了技术手段,也对其他黄酮类化合物的合成与利用具有重要的指导意义。