研究背景和目的恶性肿瘤是人类健康的重大威胁之一。免疫治疗经过一个多世纪的发展,已经成为继手术、化疗和放疗之后的重要肿瘤治疗手段。免疫治疗是通过激活“肿瘤-免疫”循环,恢复机体的抗肿瘤免疫反应。CD8+T细胞作为人体适应性免疫系统的重要成员,发挥主要的抗肿瘤作用。近年来,研究发现肿瘤细胞能够激活CD8+T细胞中的免疫抑制受体来抑制后者的杀伤活性,从而逃避免疫监视和免疫清除。针对这一问题,靶向T细胞免疫抑制分子并解除免疫抑制的抗体或小分子抑制剂被大量研发。虽然这些免疫抑制阻断剂能够有效活化CD8+T细胞并在临床中取得一定效果,但是仍有大量患者无法从此类治疗中获益。因此,尚需对CD8+T细胞中免疫抑制受体的表达调控进行深入研究,为提升肿瘤免疫治疗效果提供方向。目前,已发现了数十种T细胞免疫抑制受体。其中,对于程序性细胞死亡蛋白1(programmeddeath-1,PD-1),T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(Tcell immunoglobulinandmucindomain-3,TIM-3)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4,CTLA-4)等的研究较多。针对单个靶点的阻断或多靶点联合阻断,能够一定程度上解除T细胞免疫抑制。但是不同免疫抑制受体间存在补偿效应,即阻断一个或数个受体不能完全解除T细胞免疫抑制。针对这一困境,我们希望探讨在不同免疫抑制受体表达中都存在的调控机制,为未来免疫抑制广谱阻断药物的开发提供方向。作为蛋白质转录后修饰的一种方式,糖基化修饰在蛋白质中广泛存在,对膜蛋白质的正确定位、构象稳定、蛋白质稳定性以及活性尤为重要。因此,探讨蛋白质糖基化修饰对T细胞功能和免疫抑制受体表达的影响将有助于免疫治疗药物发现。但是,对于CD8+T细胞中蛋白质糖基化修饰的情况尚不清楚。因此,本课题主要分析了 CD8+T细胞活化过程中糖基化修饰酶的表达改变以及这种改变对T细胞功能和关键免疫抑制受体PD-1表达的影响。针对全基因组范围基因表达改变,采用高通量测序技术,尤其是染色质可及性(ATAC)测序进行研究具有较大优势。染色质可及性测序是通过转座酶结合在开放染色质的区段,通过对处理后的染色质片段进行建库测序,可以对样本染色质状态进行研究,实现全基因组范围内检测染色质的开放状态,其在研究糖基化修饰中具有重要的结构指示作用。同时第二代(RNA)测序技术因通量高,技术成熟,能够快速准确全面的检测基因的表达量,对于了解整个转录组基因表达的情况具有极大的优势,其在研究糖基化修饰相关基因具有的重要指导作用。这两者结合分析在研究糖基化修饰对CD8+T细胞功能的影响提供有力的技术支持。为了研究糖基化修饰酶对CD8+T细胞功能和免疫抑制受体的影响,本论文主要分为三部分:第一部分通过构建体外活化CD8+T细胞模拟体内肿瘤细胞通过TCR信号通路活化免疫细胞的模型,采用ATAC测序及RNA测序技术,对该活化过程中糖基化修饰酶编码基因染色质及转录组进行全面分析,寻找在细胞活化中糖基化通路的关键蛋白;第二部分通过对原代CD8+T细胞及Jurkat模式细胞进行机制研究,采用生物学信息学的方法及基因编辑的手段,筛选出在活化模型中对糖基化通路具有重要调控意义的分子,并验证其对免疫抑制分子PD-1糖基化的调控作用,最终探究对T细胞功能的影响;第三部分通过采用异种移植瘤动物模型、临床肿瘤患者样品及GEO数据库,进行分析及验证所筛选的分子对CD8+T细胞的糖基化修饰进行的调控及机制,为未来提高免疫治疗效果提供新思路。第一部分 CD8+T细胞活化过程中糖基化修饰酶编码基因的染色质可及性和转录全景式分析:为了观察糖基化修饰酶在T细胞活化不同阶段的改变,我们利用抗CD3和抗CD28抗体对健康人来源的幼稚CD8+T细胞分别刺激0天,3天和7天。取活化不同时间的T细胞进行ATAC测序,确认送检样品和测序数据质量符合后续研究要求后,对相关数据进行了生物信息学分析,分析方法主要包括主成分分析、开放区段在基因功能元件上的分布及聚类分析、开放区段相关差异基因的功能富集分析、开放区段相关基因的聚类分析,以及蛋白质转录后修饰相关通路活化分析,并对相关结果进行了可视化展现。结果显示,测序质量良好、样品聚类显著,满足了后续分析要求;在T细胞活化过程中,染色质结构出现了大范围打开状态,特别是转录起始位点附件存在大量开放片段,提示T细胞活化过程中发生了剧烈的基因转录调控;功能富集分析发现细胞活化通路相关基因被显著富集,进一步证明T细胞被充分活化;对活化不同时间的测序数据进行相关基因聚类分析发现细胞活化指示分子具有较好时间依赖性富集;联合T细胞体内活化测序数据(公共数据)分析发现,本研究构建的T细胞活化模型与体内活化模型的基因改变高度一致,提示本研究结果具有广泛生物学意义。除了糖基化修饰,蛋白质还会发生泛素化、磷酸化、甲基化等修饰。通过对这些转录后修饰相关酶编码基因的转录活性进行分析和对比,我们发现糖基化修饰基因的转录活性变化最为明显。通过对15条糖基化修饰通路进行比对分析,结果显示N连接的糖基化修饰的染色质状态具有明显的可及性调控。因此,我们接下来重点研究了 N连接糖基化修饰。为了了解在活化不同阶段糖基化修饰酶全基因转录组的改变,我们对同一批样品进行了 RNA测序分析,在确认数据质量符合后续分析要求后,进行了生物信息学分析,分析方法包括组间差异基因集合分析及聚类分析,并对相关结果进行了可视化展现。结果显示组间差异的559个基因有7个糖基化修饰酶,而位于N连接糖基化修饰通路中的岩藻糖基转移酶8(Fut8)是最具有明显差异的基因。总之,第一部分结果表明我们构建的体外T细胞活化模型能再现体内相关过程,并发现在活化过程中N连接糖基化修饰具有重要意义,且Fut8为最具有代表性的糖基化修饰酶,为后续探究糖基化对T细胞活化的机制研究提供了基础。第二部分 糖基化修饰酶Fut8对CD8+ T细胞功能以及PD-1表达的影响研究:为了验证Fut8在T细胞活化不同阶段的改变及对T细胞功能的影响,我们按照建立的活化体系对T细胞进行激活,然后分别用荧光定量PCR,免疫印迹(western blot),细胞免疫荧光,流式细胞术和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等方法在不同时间点对细胞活化水平及Fut8表达进行检测,结果提示在随着T细胞活化,Fut8表达逐渐升高;其次,我们用小干扰RNA(siRNA),采用细胞电穿孔的试验方法,敲低原代CD8+T细胞及Jurkat细胞中Fut8的表达,建立敲低细胞模型,分别用荧光定量PCR,免疫印迹,细胞免疫荧光等方法,对敲低效率进行检测,结果显示设计的小干扰RNA在基因和蛋白水平均显著降低Fut8表达;最后,我们采用ELISA和流式细胞术检测对Fut8敲低表达的CD8+T细胞进行功能检测,结果显示Fut8表达降低显著抑制T细胞杀伤和增殖功能。至此,我们确认CD8+T细胞活化促进Fut8表达,而Fut8对T细胞正常增殖和发挥杀伤功能不可或缺。接下来,我们探究了调控Fut8表达的转录因子。首先,我们结合已有的测序数据以及生物信息学进行预测,选择了 NFATc1,NFATc2,NF-kB,JUN等4个转录因子;然后对这四种转录因子分别采用了抑制剂处理,siRNA抑制,以及ATAC测序结果比对等手段分别进行验证,最终发现NFATc2是Fut8调控的关键转录因子。为了解NFATc2在细胞活化过程中的表达及对T细胞功能的影响,我们采用了荧光定量PCR,免疫印迹和细胞免疫荧光等对NFATc2进行了检测,结果显示随着T细胞活化,NFATc2表达升高;利用siRNA敲低原代CD8+T细胞及Jurkat细胞中NFATc2表达后,分别用荧光定量PCR和免疫印迹对敲低效率进行检测,结果显示NFATc2在基因和蛋白水平均显著降低。同时,在NFATc2敲低表达的细胞中,Fut8蛋白表达也下调;采用ELISA和流式细胞术对敲低NFATc2的CD8+T细胞进行功能检测,结果显示NFATc2敲低细胞的杀伤和增殖功能受到明显抑制。为了证明两者的直接调控关系,我们采用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测了 NFATc2与Fut8基因的结合,结果显示NFATc2能够结合Fut8编码基因的调控区,直接促进Fut8表达。至此,我们发现CD8+T细胞活化过程中,转录因子NFATc2表达上调并促进Fut8转录增强,进而促进T细胞增殖和杀伤活性。最后,我们探讨了 Fut8对PD-1表达的影响。我们首先采用流式细胞术、细胞免疫印迹及PCR等分析了 6种免疫抑制和活化受体,结果显示PD-1在基因和蛋白质水平存在表达不一致的情况;随后,我们对敲低Fut8表达的原代CD8+T细胞进行了 PD-1检测,结果显示敲低Fut8表达的T细胞中PD-1表达显著降低。Fut8介导的糖基化修饰对PD-1表达起到至关重要的作用。对PD-1蛋白质中存在4个潜在糖基化修饰位点进行突变后,发现第49位氨基酸(N49)和第74位氨基酸(N74)发挥主要的调控功能。为了探究在CD8+T细胞的活化过程中,岩藻糖基化修饰对PD-1的影响,我们首先用CD8+T细胞作为工具细胞,设计了针对这两个位点的单独和同时突变的基因序列,采用细胞电穿孔的试验方法进行转染,从而改变糖基化修饰位点的氨基酸,然后用免疫印迹和流式细胞术进行检测PD-1的表达;并采用糖解酶(PNGase F)处理CD8+T细胞表面的PD-1蛋白,检测其糖基化修饰的情况;还将不同位点修饰的CD8+T细胞与PD-L1共孵育,采用ELISA和荧光细胞膜标记流式细胞术等方法,检测细胞因子的分泌和细胞增殖功能。结果显示,N49和N74位点突变能够明显影响PD-1的蛋白分子量,并能降低PD-1表达,同时改变两个位点的影响最为明显;经PNGase F处理后PD-1的蛋白分子量发生了明显降低,证明了 PD-1具有糖基化修饰;在与PD-L1共孵育后,PD-1点突变的CD8+T细胞表现出更好的杀伤及增殖功能。总之,第二部分阐明了 CD8+T细胞在活化过程中转录因子NFATc2通过调控糖基化通路影响细胞功能以及PD-1表达。因此在开展了体外研究之后,我们在小鼠模型以及临床样本中对上述结果进行了验证。第三部分 利用动物模型及临床样本验证Fut8对CD8+T细胞的影响:在明确了 NFATc2-Fut8通路对T细胞的调控后,我们首先利用嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和异种移植瘤动物模型进行了体内验证。我们向免疫缺陷鼠(SCID-Beige)进行了间皮素阳性肿瘤细胞皮下接种。接种后第五天,予以尾静脉注射靶向间皮素的CD8+CAR-T细胞。注射CAR-T细胞三天后,处死小鼠,分离瘤体和脾脏。对剥离的瘤体和脾脏进行处理后得到单细胞悬液,并进行磁分选得到CD8+T细胞。然后,采用免疫印迹,细胞免疫荧光和流式细胞术等方法对NFATc2,Fut8和PD-1进行检测,并对代表细胞活化及功能的CD69和IFN-γ进行检测,结果显示与脾脏来源的细胞相比,肿瘤来源的T细胞活化程度较高,且NFATc2,Fut8和PD-1表达较强。由此我们可以得出结论,NFATc2-Fut8通路在T细胞活化中非常重要。为了验证相关基因在人体中的变化,我们对新鲜分离的肺癌患者外周血和肿瘤浸润CD8+T细胞进行了检测,结果显示NFATc2,Fut8和PD-1在肿瘤浸润T细胞中较外周血表达高,且肿瘤浸润CD8+T细胞具有广泛糖基化修饰,与前期结果一致。我们还从GEO数据库中筛选了未经治疗的肺癌患者癌及癌旁分离的CD8+T细胞的测序数据,比对了 PD-1,Fut8和NFATc2的表达,结果显示癌与癌旁PD-1表达无差异,但Fut8和NFATc2的表达癌高于癌旁,与前期研究结果一致。因此,本论文从体内外以及临床样本验证了 NFATc2-Fut8通路介导的岩藻糖基化修饰在T细胞活化以及PD-1表达中发挥了重要作用。该条通路的阐明对于未来针对蛋白质糖基化修饰的临床免疫治疗提供了新思路,有助于推动相关治疗进步。