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第一部分VA缺乏对母婴隔离大鼠孤独症样行为的影响目的:探讨孕期开始的VAD对母婴隔离导致的仔鼠孤独症样行为的影响及下丘脑RA受体与孤独症相关蛋白CD38-OXT表达变化。方法:建立孕期开始的VAN和VAD母鼠模型,于生后将两组仔鼠随机分为未隔离组和母婴隔离组(NMS组),分别构建VAN、VAD、VAN-NMS和VAD-NMS四组实验仔鼠。6w龄时,进行旷场实验、社会交往实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验,检测子代大鼠行为表现。高效液相色谱法检测血清视黄醇水平,Western blot检测下丘脑组织RARβ和CD38蛋白表达水平,ELISA检测血清OXT含量。结果:⑴VAN、VAN-NMS组大鼠的血清视黄醇水平均显著高于VAD、VAD-NMS组(P<0.001,P<0.001),视黄醇水平符合实验要求。⑵与VAN组比较,VAD组大鼠自身梳理行为时间较长(P<0.001)、玩玩具时间增加(P<0.01)而与同伴互动时间减少(P<0.001)、在开放臂时间较短(P<0.05)、大小便次数增加(P<0.01)、首次不动时间和总挣扎时间短而总不动时间长(P<0.001),表明VAD可增加大鼠的重复刻板行为、社会交往障碍、焦虑和绝望情绪。⑶与VAN组比较,VAN-NMS组大鼠的自身梳理时间长(P<0.05)、玩玩具时间增加(P<0.05)而与同伴互动时间减少(P<0.05)、在开放臂的时间短(P<0.05)、大小便次数多(P<0.05),首次不动时间和总挣扎时间短(P<0.001)而总不动时间长(P<0.01),表明母婴隔离可导致大鼠孤独症样行为表现。⑷与VAN-NMS组比较,VAD-NMS组大鼠的自身梳理时间长(P<0.001)、玩玩具时间增加(P<0.001)而与同伴互动时间减少(P<0.001)、在开放臂的时间短(P<0.05)、大小便次数多(P<0.05),首次不动时间和总挣扎时间短(P<0.01,P<0.001)而总不动时间长(P<0.01),表明VA缺乏加重母婴隔离大鼠的孤独症样行为。⑸无论是母婴隔离还是未隔离大鼠,VA缺乏大鼠下丘脑RARβ和CD38蛋白表达水平显著低于VA正常大鼠(P<0.001,P<0.001),且其血清OXT含量也较VA正常大鼠明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论:⑴母婴隔离导致大鼠表现孤独症样行为。⑵孕期开始的VA缺乏加重母婴隔离大鼠的孤独症样行为表现。⑶VA缺乏导致大鼠下丘脑组织中RARβ和CD38蛋白表达水平降低,血清OXT含量减少;且VAD与母婴隔离的双重作用会进一步减少CD38-OXT的表达水平。第二部分VA补充改善VAD母婴隔离大鼠孤独症样行为目的:探讨给予VAD-NMS大鼠VA补充对其行为的影响,以及下丘脑RA受体与孤独症相关蛋白CD38-OXT表达变化。方法:VAD-NMS仔鼠生后VA补充(VAS-NMS组),同时以未补充组作为对照(VAD-NMS组)。6w龄时,进行旷场实验、社会交往实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验,检测子代大鼠行为表现。高效液相色谱检测血清视黄醇水平,Western blot检测下丘脑组织RARβ和CD38蛋白表达水平,ELISA检测血清OXT含量。。结果:⑴VAS-NMS组大鼠血清视黄醇浓度明显高于VAD-NMS组(P<0.05)。⑵与VAD-NMS组比较,VAS-NMS组大鼠自身梳理时间缩短(P<0.001)、玩玩具时间缩短(P<0.05)而与同伴互动时间延长(P<0.05)、在开放臂的时间延长(P<0.001)、大小便次数减少(P<0.01)、首次不动时间和总挣扎时间延长而总不动时间缩短(P<0.001),表明VA及时补充缓解了VAD-NMS大鼠的孤独症样行为。⑶VAS-NMS组大鼠下丘脑中RARβ和CD38蛋白表达水平及血清OXT含量均显著高于VAD-NMS组(P<0.05)。结论:⑴生后给予VAD-NMS大鼠补充VA,可提高其血清视黄醇水平。⑵VA补充可改善VAD-NMS大鼠的孤独症样行为表现。⑶VA补充不仅可促进VAD-NMS大鼠下丘脑组织中RARβ和CD38蛋白表达水平,而且可提高血清OXT含量,提示VA及时干预可辅助治疗VAD-NMS大鼠的孤独症样行为。第三部分RARβ调控CD38信号通路的分子机制初探目的:体外探讨RARβ介导的RA信号对孤独症相关蛋白CD38表达水平的调控。方法:体外培养胎鼠下丘脑原代神经元,利用神经元特异性标记NSE进行鉴定。采用不同浓度RA处理,寻找下丘脑原代神经元中优势RARs;Real-time PCR和Western blot分别检测RARβ和CD38的m RNA和蛋白表达水平。进一步利用Ad-RARβ过表达腺病毒、si RARβ腺病毒进行干预,分别构建RFP、RFP+RA、Ad-RARβ+RA和si RARβ+RA四个实验组,Western blot检测下丘脑原代神经元中RARβ和CD38的蛋白表达水平。Ch IP-q PCR技术检测RA干预后RARβ与CD38启动子的相互作用方式,钙影像技术检测细胞内Ca2+浓度的变化。结果:⑴原代培养的胎鼠下丘脑神经元经NSE染色,免疫荧光鉴定,纯度达95%以上,可用于后续研究。⑵经不同浓度RA处理后,原代神经元中RARβ表达水平升高趋势明显,且在RA1μmol/L时RARβ升高显著(P<0.001)。此时原代神经元中的CD38 m RNA及蛋白表达水平也有显著增加(P<0.01)。⑶进一步采用腺病毒过表达或抑制RARβ,发现Ad-RARβ+RA组中CD38蛋白表达水平较RFP+RA组明显增加(P<0.05),而si RARβ+RA组CD38蛋白表达水平却显著低于RFP+RA组(P<0.05)。⑷Ch IP-q PCR检测结果发现,RA干预可诱导RARβ蛋白富集在CD38启动子区(P<0.05)。(5)钙影像检测结果表明,KCL刺激可激活RA处理的原代神经元胞内Ca2+浓度增加(P<0.001)。结论:RA可上调下丘脑原代神经元中RARβ信号通路,促进CD38的表达,其作用机制可能是RARβ与CD38启动子区相结合,促进RA诱导神经元中胞内钙活性增强,调控OXT的释放,从而影响机体的社会行为。