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第一部分高糖环境对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的影响目的:探讨不同浓度葡萄糖对体外培养的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(破骨前体细胞)增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:1.选取RAW264.7细胞,分为五组,分别用不同浓度的葡葡糖(5.5、11、22、33、44mM)干预培养,Glc 5.5mM组为Control组。检测以下指标:(1)细胞增殖水平(EdU法和MTT法);(2)细胞周期和细胞凋亡率(流式细胞术);(3)ROS水平(荧光显微镜)。2.选取RAW264.7细胞,分为四组,设置正常CON组(Glc 5.5mM)、高糖HG组(Glc 22mM),以及加入抗氧化剂NAC(5mM)处理的HG+NAC组、CON+NAC组。检测以下指标:(1)细胞增殖水平(MTT法);(2)ROS水平(荧光显微镜)(3)Cyclin D1蛋白的表达水平(Western Blot)。结果:1.EdU法和MTT法的结果均显示,高糖可以促进RAW264.7细胞增殖,与Control组相比,Glc 22mM组促增殖作用明显(P<0.01);细胞周期检测显示:Glc22mM组与Control组相比,其主要表现为G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,DNA的合成活跃,细胞增殖明显(P<0.01);细胞凋亡检测显示,随着葡萄糖浓度的增加,细胞凋亡率呈现增加趋势,与Control组相比,Glc 33mM组和Glc 44mM组具有显著性(P<0.01);ROS检测显示,随着葡萄糖浓度的增加,细胞内的ROS水平逐渐升高。2.MTT结果显示,加入NAC处理后,HG+NAC组的细胞增殖水平明显比HG组低(P<0.01);Western Blot法检测发现HG+NAC组Cyclin D1表达水平明显比HG组低(P<0.01);ROS结果也发现,HG+NAC组ROS水平明显低于HG组(P<0.01),NAC可以降低高糖所引起的ROS水平升高。结论:高糖(22mM)可以明显促进RAW264.7(破骨前体细胞)增殖,其机制可能与是高糖引起氧化应激有关。第二部分高糖环境对RANKL诱导破骨细胞增殖和分化的影响目的:探讨不同浓度的葡萄糖对RANKL诱导的破骨细胞增殖和分化的影响。方法:选取RAW264.7细胞,分为六组,前五组加入100ng/ml的RANKL诱导成破骨细胞,最后一组Vehicle组不加诱导剂,用不同浓度的葡葡糖(5.5、11、22、33、44mM)分别干预培养,Glc 5.5mM组为Control组。(1)细胞增殖的水平(MTT法);(2)阳性成熟破骨细胞形成情况(TRAP法);(3)骨陷窝面积大小(OAAS法);(4)Cyclin D1蛋白的表达水平(Western Blot)。结果:MTT法结果显示,与Control相比,Glc 22mM组的破骨细胞增殖最明显(P<0.01);Western Blot法结果也显示,与Control相比,Glc 22mM组的Cyclin D1的蛋白表达水平最高(P<0.01);TRAP染色法结果显示,Glc 22mM组的TRAP阳性细胞数远远多于Control组(P<0.01);OAAS法检测结果显示,与Control组相比,Glc 22mM组形成骨陷窝的面积最大(P<0.01)。结论:高糖(22mM)可明显促进RANKL诱导的破骨细胞增殖和分化,可能是糖尿病性骨质疏松症重要发病机制之一。