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目的:筛选不同敏化状态下膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)模型大鼠敏化穴位组织中差异表达的miRNA,并进行生物信息学分析,从基因调控的角度研究穴位敏化现象发生及不同敏化状态形成过程中参与的miRNA及其生物学功能,为解释穴位敏化现象的分子生物学机制提供一定的方向和参考。方法:1.穴位敏化检测与敏化状态的判定:将27只SD大鼠按1:2比例随机分为生理盐水(Normal Saline,NS)组和模型组。采用膝关节腔注射3mg/50μL单碘乙酸盐进行KOA模型制备,NS组注射同剂量生理盐水。采用Von Frey电子测痛仪于造模前后对各大鼠的相关腧穴进行机械痛阈的检测,计算痛阈值变化率,并以此作为敏化程度的判定标准,筛选出高敏化发生率与低敏化发生率最接近的穴位,并以该穴痛阈值变化率来选出不同敏化状态的大鼠。2.高通量测序及生物学信息分析:提取3种不同敏化状态大鼠的敏化穴位皮下结缔组织的miRNA进行高通量测序,筛选差异表达miRNA,并运用q RT-PCR方法验证显著差异miRNA的表达水平;对表达差异显著的miRNA进行生物信息学分析,通过miRanda预测靶基因,同时基于Gene Ontology数据库进行靶基因的GO富集分析,以KEGG Pathway为单位进行通路分析,探讨差异miRNAs的生物学功能及调控的信号通路。结果:1.两组大鼠造模前后穴位痛阈值比较(1)组间比较:造模后,与NS组相比,模型组大鼠的梁丘、血海、鹤顶、内膝眼、犊鼻、足三里、三阴交、阴陵泉、阳陵泉、悬钟、太冲穴的痛阈值显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05);(2)组内比较:与造模前相比,模型组大鼠的梁丘、血海、鹤顶、内膝眼、犊鼻、足三里、三阴交、左右肾俞穴的痛阈值在造模后明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.大鼠敏化穴位的高低敏化发生率统计模型组大鼠各敏化穴位在每只大鼠中的高敏化和低敏化发生次数并计算发生率,发现足三里穴和犊鼻穴的高敏化发生率和低敏化发生率相同,但由于足三里穴的敏化发生率更高,更利于后续实验的进行,因此本实验将以足三里穴作为研究对象进行不同敏化状态的高通量测序。3.差异miRNA的筛选结果(1)低敏化组与非敏化组比较,共筛选出32条差异表达的miRNA,22条上调,10条下调。其中,与非敏化组相比,低敏化组有4条miRNA显著上调:rno-miR-199a-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-205;(2)高敏化组与非敏化组比较,共筛选出20条差异表达的miRNA,7条上调,13条下调。其中,与非敏化组相比,高敏化组有4条miRNA显著上调:rno-miR-199a-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-205;(3)高敏化组与低敏化组比较,共筛选出17条差异表达的miRNA,10条上调,7条下调。其中,与低敏化组相比,高敏化组有1条miRNA显著下调:rno-miR-543-3p。4.生物信息学分析结果(1)敏化组(高敏化组和低敏化组)与非敏化组比较,将筛选出的4条显著差异miRNA进行靶基因预测,共得到靶基因2107条,对相应靶基因进行GO功能分析,差异miRNA的靶基因参与的生物过程包括受体活性的负调控、α-βT细胞增殖的负调控等;细胞组成包括AMP活化蛋白激酶复合物、ER-线粒体膜接触位点等;分子功能包括受体激动剂活性、AMP活化蛋白激酶活性等。对相应靶基因进行KEGG信号通路分析,差异miRNA的靶基因参与的信号通路包括p53信号通路、Hedgehog信号通路、MAPK信号通路等;(2)高敏化组与低敏化组比较,将筛选出的1条显著差异miRNA进行靶基因预测,共得到靶基因25条,对相应靶基因进行GO功能分析,差异miRNA的靶基因参与的生物过程包括炎症反应的正调控、细胞对活性氧的反应等;细胞组成包括纺锤体等;分子功能包括单链DNA结合、细胞因子活性等。对相应靶基因进行KEGG信号通路分析,差异miRNA的靶基因参与的信号通路包括MAPK信号通路、FcεRI信号通路、Jak-STAT信号通路等。5.q RT-PCR验证结果对5个表达差异显著的miRNA进行验证,结果显示:低敏化组与非敏化组比较,rno-miR-199a-3p和rno-miR-205表达上调,差异有统计学意义(p<0.05),与高通量测序结果一致,rno-miR-199a-5p、rno-miR-214-3p表达上调,但差异无统计学意义;高敏化组与非敏化组比较,rno-miR-199a-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-205表达上调,但差异无统计学意义;高敏化组与低敏化组比较,rno-miR-543-3p表达下调,但无统计学意义。结论:1.高敏化和低敏化状态大鼠的敏化穴位组织中rno-miR-199a-3p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-205较非敏化状态显著上调,这4条差异miRNA可能参与穴位敏化发生的调控机制;2.高敏化状态大鼠的敏化穴位组织中rno-miR-543-3p较低敏化状态显著下调,这条差异miRNA可能参与不同敏化状态形成过程的调控机制。