背景:原发性肝癌目前在恶性肿瘤中发病率居第六位,死亡率排名第三位。原发性肝癌包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）（占75%-85%）和肝内胆管癌,以及其他罕见类型[1]。HCC的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）或丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染、摄入黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、超重、2型糖尿病和吸烟等[1]。由于早期HCC往往无症状,HCC患者通常在中期或晚期才被确诊,往往会错过治愈性治疗（肝切除或肝移植）的机会。对于晚期HCC患者,治疗选择包括局部消融、放疗、化疗和分子靶向治疗[2]。其中,多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼是最早用于治疗晚期HCC的一线药物。但是激酶抑制剂等分子靶标药物疗效有限,易产生耐药,仅少部分患者获益,索拉非尼仅将患者的总生存期延长2.8个月[3]。由于目前化疗药物的疗效非常有限,因此深入了解肿瘤发生机制和开发新靶点小分子化疗药物迫切需要。众所周知,持续增殖是肿瘤最重要的特征之一[4]。在实体瘤内,无限增殖的肿瘤细胞过度消耗营养物质,肿瘤内部血管形成畸形等因素导致了周围环境营养限制（例如葡萄糖缺乏）[5,6]。因此,为了维持细胞增殖和存活,肿瘤细胞发生代谢重塑以供应能量需求和生物分子合成[7,8]。1920年,德国生物化学家Otto Warburg首次提出,肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下也倾向于将葡萄糖转化为乳酸。这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应[9],其特征是葡萄糖摄取和乳酸产生增强,尽管产生ATP的效率较低,这个过程中产生的代谢中间物可用于合成肿瘤生长所需的生物大分子[9]。作为糖酵解的逆向反应,糖异生是非糖的前体物质（如丙酮酸、乳酸和甘油等）合成葡萄糖或糖原的过程,主要发生在肝脏,对肿瘤生长和代谢重编程也起着重要调控作用[10,11]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（Phosphoenolpyruvate carboxykinase1,PCK1）是糖异生的第一步限速酶,催化草酰乙酸（OAA,Oxaloacetate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP,Phosphoenolpyruvate）。已有报道发现,PCK1与肿瘤发生发展密切相关,但是在不同组织来源的肿瘤中发挥着不同的作用。肝癌细胞中PCK1呈现低表达,使用糖皮质激素上调PCK1表达可以抑制HCC细胞增殖[12]。我们课题组前期研究也发现,在低糖条件下,过表达PCK1能够激活AMPK/p27信号通路,阻滞细胞周期G1向S期转换和抑制HCC增殖[13]。然而,在黑色素瘤细胞中过表达PCK1反而促进了糖代谢的逆向流动,增加更多的中间代谢物合成以满足其旺盛的生长需求[14]。PCK1在结肠癌中高表达,能够促进结肠癌的生长[15,16]。上述研究提示,PCK1在糖异生器官（肝脏和肾脏）中表现出抗肿瘤作用,但在非糖异生器官来源的肿瘤中却具有促肿瘤作用。然而,PCK1在不同组织来源肿瘤中的差异表达、生物学功能以及潜在的调控机制尚不明确。氧连接N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine,O-Glc NAc）修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,调控蛋白质的稳定性、酶活性、蛋白间相互作用和亚细胞定位等,从而调节各种生物学效应[17]。与磷酸化修饰不同的是,O-Glc NAc糖基化修饰由唯一的O连接N-乙酰葡糖胺转移酶（O-Glc NAc transferase,OGT）或O-连接N-乙酰葡糖胺去除酶（O-Glc NAcase,OGA）将N-乙酰葡萄糖胺（Glc NAc）连接到（或去除）靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸的羟基上[18]。二磷酸尿苷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺（UDP-Glc NAc）是蛋白质O-Glc NAc修饰的供体底物,来源于己糖胺生物合成途径（Hexosamine biosynthetic pathway,HBP）,由葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰辅酶A和核苷酸合成[19]。O-Glc NAc修饰水平主要决于细胞UDP-Glc NAc的浓度,因此被视作为一种重要的细胞营养感受器[17]。谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰基转移酶（Glutamine-Fructose-6-Phosphate Amidotransferase 1,GFAT1）是HBP通路的第一个限速酶和关键调控节点,可将果糖-6-磷酸（F6P）和谷氨酰胺（Glutamine）催化为6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸。据报道,激活AMPK可以磷酸化GFAT1蛋白243位丝氨酸,从而抑制GFAT1酶活性,降低HBP流量和蛋白O-Glc NAc修饰水平[20]。O-Glc NAc修饰在多种类型的肿瘤中增加,并与肿瘤的发生发展密切相关,被视作是肿瘤细胞新的重要特征之一[21]。越来越多癌症相关的蛋白,例如c-Myc、β-Catenin、snail1,被证明存在O-Glc NAc修饰,通过多种机制调控肿瘤的致瘤信号通路,包括:细胞增殖、能量合成、血管生成、组织侵袭和转移、细胞死亡、氧化和代谢应激等[22]。细胞O-Glc NAc修饰的深入研究有助于认识蛋白质翻译后修饰在肿瘤发生发展中的作用,解释肿瘤细胞如何感受营养状态并协调基因表达,进一步加深我们对肿瘤发生机制的理解,为寻找肿瘤诊断和预后相关标志物提供新的线索,并有助于开发新的防治策略。因此,我们提出以下科学问题:葡萄糖缺乏条件下糖异生关键酶PCK1是否通过调控细胞HBP和蛋白O-Glc NAc修饰,进而调控肝癌细胞的增殖?实验方法:1.观察低糖环境下,干预PCK1表达对肝癌细胞蛋白O-Glc NAc修饰水平的影响。首先在PLC/PRF/5、SK-Hep1、Huh7和MHCC-97H肝癌细胞系敲除或过表达PCK1,并给予不同浓度葡萄糖培养基处理12小时,观察不同糖条件下PCK1敲除或过表达后对O-Glc NAc修饰水平和细胞增殖的影响。同时,构建Pck1肝脏敲除小鼠DEN诱导肿瘤模型和裸鼠肝脏原位成瘤模型验证体外实验结论。通过荧光定量PCR和Western Blot实验观察PCK1对HBP代谢和O-Glc NAc修饰的关键酶OGT、OGA和GFAT1的m RNA和蛋白表达水平的影响。另外,在肝癌细胞中过表达PCK1酶失活突变体G309R观察O-Glc NAc修饰水平变化,明确PCK1的代谢酶活性是否在调节O-Glc NAc修饰水平中起着关键作用。2.检测PCK1敲除细胞内OAA和UDP-Glc NAc水平。采用非靶标代谢物组和靶标代谢物质谱分析技术检测低糖条件下PCK1对TCA循环中间代谢物、HBP关键代谢物UDP-Glc NAc和UTP从头合成途径代谢物水平的调控。外源添加OAA、天门冬氨酸（Asp）,观察是否影响肝癌细胞UDP-Glc NAc合成、O-Glc NAc修饰水平及细胞增殖。GOT2是催化OAA生成Asp的重要代谢酶,GOT2抑制剂AOA处理PCK1敲除细胞,进一步明确观察是否能阻断此过程,确定PCK1敲除后通过OAA累积促进Asp及UDP-Glc NAc生物合成。进一步利用同位素示踪法标记13C5-谷氨酰胺,检测m+4 OAA和m+3 UDP-Glc NAc等代谢物水平变化。3.观察过表达PCK1能否激活p-AMPK/p-GFAT信号轴。通过Western Blot实验观察敲除或过表达PCK1对p-AMPK/p-GFAT1信号轴及O-Glc NAc修饰水平变化。AMPK激活剂或敲低基因技术干预p-AMPK/p-GFAT1信号轴确定PCK1抑制GFAT1活性、O-Glc NAc修饰和肝癌细胞增殖是否依赖于p-AMPK。采用靶标代谢物质谱技术检测DON干预p-GFAT1关键酶后PCK1敲除细胞UDP-Glc NAc水平变化。4.观察PCK1敲除后对CHK2 O-Glc NAc修饰水平的影响。为了进一步寻找在PCK1敲除的细胞中哪些重要蛋白发生O-Glc NAc修饰促进肝癌细胞的增殖,我们首先构建了OGT融合Flag标签重组质粒。低糖处理PCK1敲除肝癌细胞,并过表达OGT融合Flag标签蛋白,采用免疫沉淀联合质谱检测靶标结合蛋白。IP-MS富集并筛选出重要的调控周期蛋白Checkpoint kinase 2（CHK2）。采用Co-IP及IP实验验证CHK2是否与OGT发生相互作用,是否发生O-Glc NAc修饰。采用质谱技术初步鉴定、IP实验确证CHK2 O-Glc NAc修饰的重要位点。构建CHK2修饰位点突变质粒验证CHK2发生O-Glc NAc修饰的关键位点。5.明确CHK2发生O-Glc NAc修饰后其生物学功能的改变。采用泛素化IP实验观察过表达PCK1对CHK2泛素化修饰的影响。蛋白合成抑制剂CHX处理观察发生CHK2 O-Glc NAc修饰对其蛋白稳定性的影响。通过Co-IP实验、寡聚体交联和分子动力学模拟实验观察发生CHK2 O-Glc NAc修饰对二聚体形成情况的影响。敲除或过表达PCK1、O-Glc NAc修饰调控或外源添加PEP或OAA,进一步观察对CHK2及下游p-CDK2/p-Rb通路激活和肝癌增殖影响情况。进而在PCK1/CHK2双敲除肝癌细胞中恢复野生型CHK2或位点突变CHK2观察下游信号轴和细胞增殖情况。同时,构建裸鼠肝脏原位成瘤模型验证体外实验结论。6.在临床肝癌组织样本中分析PCK1与肿瘤大小、O-Glc NAc修饰和p-Rb表达的相关性。临床数据和40对临床原发性肝癌与癌旁组织样本中,我们采用Western blot蛋白定量分析PCK1表达、O-Glc NAc修饰、CHK2 O-Glc NAc修饰。同时分析PCK1表达与肿瘤大小、O-Glc NAc修饰和p-Rb表达的相关性。7.在DEN/CCl4诱导Pck1肝脏敲除小鼠肿瘤模型中观察干预HBP后肿瘤增殖情况。繁殖筛选出Pck1肝脏特定敲除纯合子小鼠,采用DEN联合CCl4诱导肝癌形成。诱导8个月后观察小鼠DEN诱导肿瘤结节数,通过质谱分析、Western Blot、s WGA等技术检测UDP-Glc NAc、蛋白O-Glc NAc修饰和CHK2 O-Glc NAc修饰水平。观察给予HBP相关抑制剂DON及谷草转氨酶2抑制剂AOA治疗对小鼠肝肿瘤生长的影响。结果:1.低糖环境下肝癌细胞PCK1敲除后促进蛋白O-Glc NAc修饰水平:在PLC/PRF/5、SK-Hep1、Huh7和MHCC-97H肝癌细胞中分别敲除或过表达PCK1,并给予不同浓度葡萄糖培养基处理12 h,发现5m M葡萄糖条件下PCK1敲除促进O-Glc NAc修饰和细胞增殖,过表达PCK1结果相反。在Pck1肝脏敲除小鼠DEN诱导肿瘤模型和裸鼠肝脏原位成瘤模型验证了相同结论。进一步发现,PCK1并不能影响HBP和O-Glc NAc修饰的关键酶OGT、OGA和GFAT1的m RNA水平和蛋白表达;有趣的是,过表达PCK1酶失活突变体G309R并不能改变O-Glc NAc修饰,说明PCK1的酶活性可能在调节O-Glc NAc修饰水平中起着关键作用。2.PCK1敲除后通过增加OAA累积促进UDP-Glc NAc合成:采用非靶标代谢物组和靶标代谢物质谱分析发现低糖条件下PCK1下调TCA循环中间代谢物、HBP关键代谢物UDP-Glc NAc以及UTP合成相关代谢。OAA和Asp增加UDP-Glc NAc合成和O-Glc NAc修饰水平及促进肝癌细胞增殖,PCK1敲除细胞给予GOT2（GOT2,催化OAA生成Asp）抑制剂AOA能阻断此过程,说明PCK1敲除后通过OAA累积增加Asp和UDP-Glc NAc合成。进一步利用同位素示踪法标记13C5-谷氨酰胺分析发现过表达PCK1减少肝癌细胞中OAA m+4、Orotate m+4和UDP-Glc NAc m+3,此验证了上述结论。3.过表达PCK1通过激活p-AMPK/p-GFAT1信号轴减少UDP-Glc NAc合成和O-Glc NAc修饰水平:过表达PCK1增加了AMPK和GFAT1的磷酸化,反之PCK1敲除降低两者磷酸化水平。在PCK1敲除细胞给与p-AMPK激活剂二甲双胍Met处理后观察到激活的p-AMPK激活p-GFAT1并抑制O-Glc NAc修饰水平和肝癌细胞增殖。GFAT1抑制剂DON处理后,可以降低PCK1敲除细胞UDP-Glc NAc和O-Glc NAc修饰水平,并抑制肝癌增殖。4.PCK1敲除后增强CHK2蛋白O-Glc NAc修饰:通过IP-MS实验和通路富集分析发现在PCK1敲除细胞中CHK2可能是与OGT结合的潜在靶蛋白。Co-IP及IP实验验证了CHK2与OGT发生相互作用,并发生O-Glc NAc修饰。进一步实验发现过表达PCK1或给与OGT抑制剂ST降低了CHK2 O-Glc NAc修饰水平;反之敲除PCK1或给与OGA抑制剂PUGNAc和代谢物OAA增强其修饰。质谱技术分析及IP实验显示Thr378是CHK2发生O-Glc NAc修饰的重要位点。5.CHK2蛋白O-Glc NAc修饰增强其稳定性和二聚体形成,通过激活p-CDK2/p-Rb信号轴促进肝癌细胞增殖:通过IP和蛋白稳定性实验发现Thr378位点O-Glc NAc修饰的CHK2泛素化降解减少和蛋白稳定性增加。进一步实验发现O-Glc NAc修饰促进CHK2二聚体形成。过表达PCK1或给与抑制剂ST减少CHK2表达及抑制下游p-CDK2/p-Rb通路和肝癌增殖;相反,敲除PCK1或给与抑制剂PUGNAc和代谢物OAA激活其下游通路。在PCK1/CHK2双敲除肝癌细胞中恢复T378A CHK2不能激活下游p-CDK2/p-Rb通路信号轴和细胞增殖情况,说明CHK2 T378位点O-Glc NAc修饰参与着重要作用。同时,构建裸鼠肝脏原位成瘤模型验证了体外实验结论。6.肝癌组织中PCK1表达与CHK2 O-Glc NAc修饰以及p-Rb表达呈负相关:通过对40对临床原发性肝癌组织与癌旁组织相比较,发现肿瘤组织中PCK1表达降低,而蛋白O-Glc NAc修饰、CHK2 O-Glc NAc修饰和p-Rb表达增高。相关性分析发现PCK1表达与肿瘤大小、O-Glc NAc修饰和p-Rb表达呈负相关。7.Pck1敲除小鼠肝癌模型中验证HBP通路抑制剂抗肝癌疗效:采用DEN/CCl4诱导Pck1敲除小鼠肝癌模型,发现Pck1敲除小鼠肝脏肿瘤结节数多于野生型,其中UDP-Glc NAc、整体O-Glc NAc修饰和CHK2 O-Glc NAc修饰水平增加。给予HBP相关抑制剂AOA和DON治疗能抑制肿瘤生长,提示靶向HBP代谢通路可能是肝癌潜在的干预靶点之一。结论:研究结果揭示了在低糖条件下糖异生酶PCK1缺失增强HBP和O-Glc NAc修饰,并促进HCC增殖。我们证明了PCK1缺失通过OAA累积、激活GFAT1促进UDP-Glc NAc合成和O-Glc NAc修饰的分子机制,并阐明了CHK2 O-Glc NAc修饰在HCC进展中的重要性。上述研究揭示了糖异生酶PCK1与HBP介导的O-Glc NAc修饰之间的新联系,发现了己糖胺代谢的小分子抑制剂DON和AOA具有抑瘤作用,为靶向肝癌的代谢治疗提供了一种新策略。