【摘 要】
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产志贺毒素大肠杆菌（Shiga Toxin producing Escherichia coli,STEC）是一种危害严重的食源性和水源性人畜共患病原菌,可引起人类的严重疾病。主要通过被STEC污染的食品、水和新鲜农产品是来传播。志贺毒素（Shigatoxin,Stx）是STEC的主要毒力因子,Stx会破坏肠粘膜上皮细胞的蛋白质合成,导致细胞死亡,粘膜脱落,最终导致腹泻。因此,Stx已经成为诊断、
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产志贺毒素大肠杆菌（Shiga Toxin producing Escherichia coli,STEC）是一种危害严重的食源性和水源性人畜共患病原菌,可引起人类的严重疾病。主要通过被STEC污染的食品、水和新鲜农产品是来传播。志贺毒素（Shigatoxin,Stx）是STEC的主要毒力因子,Stx会破坏肠粘膜上皮细胞的蛋白质合成,导致细胞死亡,粘膜脱落,最终导致腹泻。因此,Stx已经成为诊断、治疗STEC感染并发症的靶向分子,本研究拟通过克隆及原核表达志贺毒素Ⅰ型A亚基（Stx1A）、志贺毒素Ⅰ型B亚基（Stx1B）、志贺毒素Ⅱ型A亚基（Stx2A）和志贺毒素Ⅱ型B亚基（Stx2B）,为STEC感染病发症的Stx靶向治疗相关研究奠定基础。本试验从犊牛粪便中分离出了一株菌,通过16S rRNA基因鉴定,该菌与大肠埃希氏菌STEC413同源性最高。通过常用血清型引物PCR扩增表明该菌为O-抗原血清型O45,致病性试验鉴定该菌株为有毒力菌株,对阿莫西林、恩诺沙星、氟苯尼考敏感,对红霉素、庆大霉素、链霉素耐药。采用PCR技术从分离菌株中扩增分离了Stx1A、Stx1B、Stx2A和Stx2B四段基因,经序列分析,结果与参考序列同源性达 90%以上。成功构建克隆载体 pEASY-Stx1A、pMD18-T-Stx1B、pEASY-Stx2A 和pMD18-T-Stx2B,目的基因片段分别为972bp、294bp、984bp和294bp。并成功构建了 原核表达质粒 pET-28a（+）-Stx1 A、pET-28a（+）-Stx1B、pET-28a（+）-Stx2A 和pET-28a（+）-Stx2B,经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白大小分别为38kDa、13kDa、38.9kDa和13kDa,与预期大小一致。Western blot检测结果显示四种蛋白都具有良好反应原性。本研究成功构建了 pET-28a（+）-Stx1A、pET-28a（+）-Stx1B、pET-28a（+）-Stx2A 和pET-28a（+）-Stx2B四种重组载体,经Western blot检测证明表达的Stx1A、Stx1B、Stx2A和Stx2B蛋白均能与特异性抗体反应,具有良好的反应原性,为后续研究奠定基础。
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