论文部分内容阅读
一直以来传统的治疗方法存在着各种各样的弊端,给患者带来痛苦的同时疾病并不能得到根治。随着医学水平的发展,人们开始思考从基因水平上对疾病实施有效且根本性的治疗,基因治疗由此逐渐引起了人们的关注。因此本文开发一种基于还原敏感响应的纳米基因递送系统,利用细胞内高GSH浓度呈现出的还原性环境,实现载体在细胞内更快速的释放基因,从而达到高的转染效率。本论文主要的研究内容及结果如下:1.还原敏感响应基因递送载体的合成及表征。以侧链被二亚乙基三胺(DET)修饰的聚天冬氨酸P[Asp(DET)]为结合基因的亲水段,含有二硫键的胱胺作为连接臂,与疏水性聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA连接合成新的还原敏感响应的基因载体PLGA-ss-P[Asp(DET)](后文统一采用P-ss-P表示)。己二胺代替胱胺,连接PLGA与聚阳离子P[Asp(DET)],合成不含还原敏感二硫键的PLGA-P[Asp(DET)](后文统一采用P-P表示)作为对照;同时不含疏水链段的P[Asp(DET)]作为阳性对照。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振氢谱(~1H NMR)对P-ss-P的化学结构进行表征,结果表明P-ss-P成功合成。载体P-ss-P在水溶液中能够自组装形成纳米颗粒,透射电镜(TEM)显示纳米颗粒呈分布较均匀的近似球形,粒径在20-30 nm左右,且在144 h内具有较好的稳定性。缓冲能力实验表明P-ss-P具有较好的质子缓冲能力。2.P-ss-P基因载体递送外源基因能力的研究。将载体P-ss-P与报告基因pDsRed2-N1共同孵育制备载体/pDNA复合物并探究其性能。粒径及电位分析结果显示P-ss-P/pDNA复合物的粒径为在100-350 nm之间,最终平稳在120 nm左右,最大电位为30.93 mV。凝胶阻滞实验结果表明P-ss-P能与pDNA较好的结合,并且有效抵抗肝素钠的竞争。同时载体P-ss-P能有效保护pDNA被核酸酶及血清中成分降解。MTT结果显示P[Asp(DET)]、P-ss-P和P-P均具有较低的细胞毒性,并且与P[Asp(DET)]相比P-ss-P表现出更好的生物相容性。体外转染实验结果表明P[Asp(DET)]和P-ss-P均能成功运载外源基因至细胞并顺利表达,不同N/P(4、8、16)下P-ss-P/pDsRed2-N1复合物的转染效率分别为9.0%、22.3%和26.3%。激光共聚焦及细胞流式实验结果表明,P[Asp(DET)]/Cy5-pDNA、P-P/Cy5-pDNA和P-ss-P/Cy5-pDNA复合物均可通过内吞方式被HeLa细胞摄取且摄取量远高于游离pDNA,具有疏水结构的P-P和P-ss-P的细胞摄取量明显高于P[Asp(DET)]组。3.基因载体还原敏感响应性能的研究。DLS实验结果表明P-ss-P在还原条件下表现出了粒径增大现象,而在相同条件下P-P的粒径则无明显变化。电泳实验结果显示在还原条件下P-ss-P与DNA的结合能力有所减弱,并且随着孵育时间的增加,P-ss-P的DNA结合能力逐渐降低,而P-P/pDNA复合物不受还原条件的影响,在0-6 h内均完全结合DNA。在体外细胞转染方面,P-ss-P/pDsRed2-N1显示出比P-P更高的转染效率。上述结果证明了P-ss-P具有较好的还原敏感性质。4.P-ss-P用于体外癌症基因治疗效果的研究。通过MTT细胞毒性实验评估P-ss-P运载治疗基因p53的抑癌效果。与P-P相比,P-ss-P由于能更好运载抑癌基因p53进入癌细胞,表达抑癌蛋白,因而显著抑制癌细胞的生长增殖。