研究背景与目的:缺血再灌注损伤是在血栓性疾病中常见的现象。缺血心肌在得到再灌注的同时,由于激活免疫反应而导致梗塞周围出现更多的损伤,并与心肌细胞凋亡的增加有关。损伤的结果会导致心肌细胞的丢失和梗塞面积的扩大。因此,研究缺血再灌注损伤所致的心肌细胞凋亡具有重要的临床意义。有多种信号传导通路参与心肌细胞的凋亡,TLR4-NF-κB通路在其中起着重要的作用。TLR4是TOLL系列受体之一,能被多种刺激信号激活,如应激、炎症、坏死等。TLR4主要在心脏表达,将信号传导至胞内并在酶的作用下活化NF-κB,而NF-κB则进入核内引起相关基因的表达,促进炎症因子的产生。β-arrestin被认为是一种多功能受体蛋白,参与GPCR的脱敏。β-arrestin通过结合NF-κB的抑制因子IкBα而调控NF-κB基因的表达。因此,β-arrestin被认为是TLR4-NF-κB信号通路的负调控因子。卡维地洛是一种新型的非选择性β受体阻滞剂,应用于治疗高血压和心绞痛。在慢性心力衰竭患者中,卡维地洛能够降低其住院率和死亡率。在多项临床研究中,相对于其他β受体阻滞剂,卡维地洛在抑制左室重构和保持射血分数方面显示出显著的优势。这种作用涉及多种机制,抑制心肌细胞凋亡是其中之一。然而,有关卡维地洛对TLR4-NF-κB介导的心肌细胞凋亡的影响尚不清楚。卡维地洛是否能对β-arrestin产生影响更有少见报道。因此,我们准备两部分实验来探讨卡维地洛对缺血再灌注损伤心肌细胞模型中TLR4-NF-κB通路的作用以及β-arrestin表达的影响。材料与方法:第一部分H9C2心肌细胞株的培养和缺血/再灌注模型建立方法:培养H9C2心肌细胞株,采用缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤,缺氧4小时后按照复氧时间不同分为5组:对照组,复氧4h组,复氧6h组,复氧10h组。观察指标包括荧光显微镜下细胞生长形态变化,mtt值,培养液中ldh、mda及sod含量。结果:H9C2心肌细胞株在体外培养成功,并建立缺氧复氧模型。缺氧复氧后细胞形态镜下发生明显变化,表现为核染色细胞增多。在实验组中,mtt值显著下降,并随着复氧时间延长而更为显著。ldh和mda含量分别显著增加,sod则显著降低,具有显著性差异。结论:本研究在体外通过缺氧复氧而成功构建H9C2心肌细胞模拟缺血再灌注模型,缺氧4小时复氧6小时可造成显著心肌细胞损伤,为进一步实验提供标本。第二部分H9C2心肌细胞凋亡中tlr4-nfκb、β-arrestin的表达和卡维地洛的作用方法:采用不同剂量卡维地洛(1um、5um、10umol/l)、tlr4封闭抗体(20ug/ml)、nf-κb抑制剂pdtc(100umol/l)预孵育H9C2心肌细胞1h后,建立模拟缺血再灌注模型。实验分为7组:正常对照组(control组),模拟缺血再灌注组(sd组),小剂量组卡维地洛组(car1卡维地洛1umol/l),中剂量组卡维地洛组(car5卡维地洛5umol/l),高剂量组卡维地洛组(car10卡维地洛10umol/l),tlr4封闭抗体组(tlr4-ab组tlr4封闭抗体20ug/ml),nf-κb抑制剂pdtc组(pdtc组pdtc100umol/l)。应用蛋白质印迹技术检测细胞凋亡蛋白bax,bcl-2。通过荧光定量pcr法测定tlr4、核蛋白nf-κb、β-arrestin的表达。结果:H9C2心肌细胞株在i/r后,与正常对照组相比,tunnel检测细胞凋亡率增高,bax升高,bcl-2下降,tlr4和nf-κb表达增多,β-arrestin表达减少。在经过卡维地洛预处理的H9C2i/r模型中,与i/r组相比bcl-2明显增加,细胞凋亡率和bax显著降低。通过rt-pcr技术检测,在卡维地洛预处理组中,tlr4和nf-κb表达量减少,β-arrestin表达增多。上述指标的变化,在中、高剂量卡维地洛组中更为显著。tlr4抗体和nf-κb阻断剂(pdtc)预处理H9C2心肌细胞,与i/r组相比,可表现出与卡维地洛组相同的显著改变。结论:1.TLR4-NF-κB信号通路与H9C2心肌细胞株I/R所致凋亡过程有关2.卡维地洛可以通过抑制TLR4/NF-κB表达而减轻H9C2心肌细胞I/R所致的凋亡,在中、高剂量组中更为显著3.卡维地洛可能会激活β-arrestin,负调控TLR4-NF-κB信号。