家蚕(Bombyx mori)作为一种模式生物,其滞育问题一直是人们关注的焦点。家蚕的滞育出现在胚胎发育的早期,为卵滞育型。不同化性(在自然条件下一年间所发生的世代数)的家蚕发生滞育的状况不一样,一化性(univoltine)为每代都发生滞育,多化性(polyvoltine)为每代均不发生滞育,二化性(bivoltine)介于两者之间,高温(25℃)明催青时产下滞育性卵,低温(15℃)暗催青时产下非滞育性卵。决定蚕卵是否发生滞育的关键,是蛹期咽下神经节(Subpharyngeal ganglion,SG)合成和分泌的滞育激素(Diapause hormone,DH)数量的多少,当合成和分泌的DH数量多时,大量DH作用于卵巢和发育中的蚕卵,改变蚕卵内的物质代谢,使之成为滞育卵,当合成和分泌的DH数量少时,蚕卵胚胎不停地向前发育,成为非滞育卵。然而,关于“滞育信号是如何传递的”这一问题仍有待于进一步研究,目前被普遍接受的一种理论模型是:合成并分泌到血淋巴中的DH,随着血淋巴流动至卵巢,与卵巢细胞上的某种受体结合,诱导卵巢中海藻糖酶基因的表达量上调,促进糖元积累并转化为山梨醇和甘油,滞育发动。根据这一模式,滞育激素的作用是通过受体来介导的,受体在家蚕滞育发动过程中起着十分重要的作用,然而目前对家蚕滞育激素受体的相关研究并不多。为此,研究家蚕滞育激素受体,对于解明家蚕滞育激素引起蚕卵滞育的分子机理,在家蚕中建立G蛋白偶联受体的研究模型,从分子水平上来研究和调控家蚕的生理生化、病理和遗传等生命过程,均具有很高的价值,其中受体基因的克隆及表达分析是受体研究工作的基础。本实验采用RT-PCR的方法,克隆家蚕滞育激素受体基因,并对其在不同化性家蚕中五龄期、蛹期的表达进行半定量分析,主要研究结果如下:　　 1、从二化性品种丰1、蛹龄第3天的家蚕卵巢中提取总RNA,反转录获得第一链cDNA。根据果蝇FXPRLa神经肽(C端以Phe-Gly-Pro-Arg-Leu-NH2结尾的多肽)受体基因的保守序列,设计两个特异性引物5-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3和5-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTTC-3,对cDNA进行PCR扩增,克隆到家蚕滞育激素受体(BmDHR)基因并测序。BmDHR基因的cDNA全长1311 bp,含28.8％A、23.7％C、19.6％G和27.8％T,编码由436个氨基酸组成的蛋白,后者属于一种G蛋白偶联受体。　　 2、用DNAstar软件对BmDHR基因序列及另外9种GPCR的基因序列进行聚类分析,发现。BmDHR与昆虫中的神经肽受体HzPBANR及BmPBANR的基因序列有着较近的亲缘关系;进一步将BmDHR、HzPBANR和BmPBANR蛋白的氨基酸序列用ClustalW2工具进行比对,发现三者呈较高的同源性。此结果也能很好地验证本试验克隆到的cDNA为家蚕滞育激素受体基因。　　 3、收集多化、一化、二化不同处理(25℃明催青及15℃暗催青)的雌蚕五龄期及蛹期的卵巢,针对BmDHR基因序列和家蚕ActinA3基因序列分别设计特异性的目的基因引物和内标基因引物,进行半定量RT-PCR分析。结果二化性品种家蚕卵经不同催青处理后,其BmDHR基因在蚕期和蛹期的表达呈现出不同的特点,在5龄幼虫期的表达量均较低,化蛹后表达量迅速上升,高温(25℃)明催青的在蛹期第3、4天表达量达到峰值,而低温(15℃)暗催青的在蛹期第2天表达量达到峰值,此后两者均迅速下降。结果表明,产非滞育卵的家蚕也有滞育激素受体基因的表达,其表达峰值出现在蛹前期,产滞育卵的家蚕滞育激素受体基因表达峰值出现时间迟于产非滞育卵的情况,这与卵巢在蛹中期对滞育激素敏感的时间模式相一致。多化性品种蚕中,滞育激素受体基因表达量在前期波动不大,到蛹期第3天出现峰值,之后快速的下降;一化性品种蚕中,滞育激素受体基因表达量在前期基本保持恒定,在蛹期第1天出现峰值,之后在波动中迅速下降。结果表明,在化性完全由遗传决定的一化性、多化性蚕品种中,滞育激素的分泌量是决定滞育与否的关键,受体只起到接收器的作用,而在化性受环境影响的二化蚕品种中,滞育由滞育激素分泌和滞育激素受体基因表达共同决定。　　 本研究结果对于更好地认识家蚕的滞育发动过程,了解滞育激素的作用机理等具有积极的意义,同时也可为家蚕中其他G蛋白偶联受体及其他昆虫中的G蛋白偶联受体研究提供借鉴。